田玉峰，李安平*，謝碧霞，丁彥鵬，崔富貴

(中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

橡實淀粉生物乙醇化橡實品種和菌種的篩選

田玉峰，李安平*，謝碧霞，丁彥鵬，崔富貴

(中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

對湖南南岳采集的幾種橡實品種的營養(yǎng)成分和發(fā)酵性能，以及4種酵母菌對茅栗淀粉發(fā)酵的適應性能進行比較。結果表明：12種橡實品種中以茅栗、栓皮櫟、多脈青岡和錐栗等4個品種的淀粉含量及單株產量均較高，而單寧含量較低；錐栗和茅栗發(fā)酵后的醪液酒精體積分數和淀粉利用率顯著高于栓皮櫟和多脈青岡(P＜0.05)，而還原糖含量卻相反(P＞0.05)；安琪耐高溫高活性干酵母和南陽混合酵母(1308)與丹寶利高活性干酵母、K字酵母和南陽五號酵母(1300)相比，發(fā)酵后茅栗醪液酒精體積分數和醪液殘還原糖含量方面具有顯著優(yōu)勢(P＜0.05)，是橡實淀粉生物乙醇化的最優(yōu)菌種。

生物乙醇化；橡實品種；菌種；篩選

燃料乙醇的推廣將消耗大量淀粉原料，而目前燃料乙醇的生產主要是以玉米和陳化糧等糧食為原料，結果是出現與民爭糧的問題，而且這種用糧食生產燃料乙醇的方式與國家糧食戰(zhàn)略安全是相矛盾的。因此，尋求廉價易得的生物質原料成為國內外研究的熱點。

我國橡實資源相當豐富，年產橡實估計在6×106～7×106t，但其利用率非常低。橡實淀粉含量很高，一般達到50%～70%，是很好的淀粉質原料[1]。如果用橡實淀粉發(fā)酵生產燃料乙醇，不但可以節(jié)約大量的糧食，而且對開發(fā)野生植物橡實資源，發(fā)展林業(yè)經濟具有重要的意義。篩選出性能優(yōu)異的酒精酵母菌株是提高淀粉出酒率和降低原料消耗及生產成本的關鍵。本實驗以從湖南南岳采集的12種橡實品種為原料，根據橡實產量、淀粉含量、淀粉酒精轉化率等指標篩選出最適合燃料乙醇生產的橡實品種和酵母菌株，以期為規(guī)模化生產燃料乙醇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

錐栗(Castanea henryi)、茅栗(Castanea seguinii Dode)、小紅栲(Castanopsis carlesii)、栓皮櫟(Quercus variabilis Blume)、苦櫧(Castanopsis sclerophylla)、硬斗石櫟(Lithocarpus hancei)、東南石櫟(Lithocarpus harlandii)、美葉石櫟(Lithocarpus calophyllus)、長葉石櫟(Lithocarpus harlandii)、多脈青岡(Cyclobalanopsis multinervis)、細葉青岡(Cyclobalanopsis myrsinaefolia)、大葉青岡(Quercus glauca Thunb)均采自湖南南岳衡山。

安琪耐高溫高活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；丹寶利高活性干酵母 廣東丹寶利酵母股份有限公司；K字酵母、南陽五號酵母(1300)、南陽混合酵母(1308) 湖南輕工業(yè)研究所。

1.2 方法

淀粉的測定[2]：按GB/T 5514—85《糧食、油料檢驗淀粉測定法》中的酸水解法測定；單寧的測定[3]：采用硫酸亞鐵銨返滴重絡酸鉀法；粗纖維的測定[2]：按GB/T 5515—85《糧食、油料檢驗粗纖維素測定法》；總糖的測定[4]：先將總糖水解，然后用DNS法測定；蛋白質的測定[2]：按GB/T 5009.5—1985《食品中蛋白質的測定方法》中的凱氏定氮法測定；酒精度的測定[4]：取100mL成熟的發(fā)酵醪液到蒸餾燒瓶中，加100mL水，混勻后蒸餾。取餾出液100mL，用酒精比重計測定餾出液中的酒精體積分數；醪液還原糖的測定[4]：取5mL醪液過濾，將濾液稀釋至100mL容量瓶，用DNS法測定。淀粉利用率的計算[2]：由于12種橡實品種的淀粉含量不一樣，酒精體積分數與殘還原糖含量不能直接反映淀粉的實際利用率。利用橡實淀粉含量(α)和酒精體積分數(φ)可計算出淀粉利用率(v)。

式中：v為淀粉利用率/%；m為橡實原料質量/g；φ為酒精體積分數/%；α為橡實淀粉含量/%；56.82%為純淀粉的理論出酒率。

2 結果與分析

2.1 12種橡實營養(yǎng)化學成分含量

橡實種仁含有豐富的營養(yǎng)物質，特別是淀粉的含量很高，一般可達50%～70%左右。12個從湖南省南岳衡山采集的橡實品種的營養(yǎng)化學成分測定結果見表1，單株產量結果見圖1。

圖1 12種橡實單株產量Fig.1 Starch yields per plant of 12 varieties of acorn

由表1可知，12個橡實品種的淀粉含量均大于50%，但各品種之間含量有顯著性差異(P＜0.05)，其中以茅栗、栓皮櫟和多脈青岡最高，錐栗、硬斗石櫟和美葉石櫟次之，長葉石櫟淀粉含量最低；12個橡實品種的單寧的含量有顯著性差異，其中以栓皮櫟最高，苦櫧和大葉青岡次之，錐栗、硬斗石櫟、東南石櫟和長葉石櫟最低；各品種間的粗纖維、總糖和粗纖維差別不顯著(P＞0.05)。

淀粉含量越高，則橡實的生物乙醇化產量越高；單寧對酵母發(fā)酵具有一定的抑制作用，因此單寧含量越少越有助于提高乙醇產量[5]；此外，在選取適合乙醇產業(yè)化生產的橡實品種時，不僅要考慮淀粉含量和單寧含量，而且還需考慮橡實的單株產量以便產業(yè)化生產。根據林業(yè)調查，從8年生的12種橡實品種的單株產量圖可以看出，栓皮櫟產量最高，其次是茅栗、多脈青岡和錐栗。

表1 湖南省主要橡實種仁化學成分含量Table 1 Major chemical composition of acorn kernels from 12 varieties

因此，綜合考慮各因素的影響，選取茅栗、栓皮櫟、多脈青岡和錐栗等4個淀粉含量高、單寧含量低、產量高的品種做進一步淀粉的生物乙醇化轉化研究。

2.2 4種橡實品種發(fā)酵情況的比較

安琪耐高溫高活性干酵母是工業(yè)上比較成熟的生產工業(yè)酒精酵母，因此選取它對錐栗、茅栗、栓皮櫟、多脈青岡等4種橡實做發(fā)酵實驗，找出1～2種最適合生產酒精的橡實品種。

在同等條件下，分別稱取4種過80目篩的橡實淀粉各50g，按料液比1:2.5(m/V)加水調漿，加入200U/g糖化酶，在250mL三角瓶中混合均勻，接入體積分數10%活化后的酵母菌株，在34℃條件下恒溫發(fā)酵72h[6]。發(fā)酵結束后分別測定和計算各品種醪液酒精體積分數、殘還原糖含量(g/150mL)和淀粉利用率[7]。

2.2.1 4種橡實發(fā)酵后醪液酒精體積分數的比較

圖2 4種橡實發(fā)酵后醪液酒精體積分數的比較Fig.2 Comparison of alcohol contents among fermented mashes from 4 varieties of acorn starches

由圖2可知，4種橡實發(fā)酵后醪液酒精體積分數由高到低依次為錐栗、茅栗、多脈青岡、栓皮櫟。通過ANOVA檢驗差異達0.05顯著水平分析可知，錐栗和茅栗發(fā)酵后的醪液酒精體積分數沒有顯著性差異(P＞0.05)，而與栓皮櫟和多脈青岡發(fā)酵后的醪液酒精體積分數存在顯著性差異(P＜0.05)。錐栗淀粉含量雖然低于其他3個品種，但發(fā)酵后醪液酒精度卻顯著高于栓皮櫟與多脈青岡。錐栗的單寧含量遠低于栓皮櫟與多脈青岡，而單寧對酵母發(fā)酵有很大的影響，因而造成了錐栗發(fā)酵醪液酒精度高于其他兩個品種[8]。

2.2.2 4種橡實發(fā)酵后醪液殘還原糖含量的比較

殘還原糖含量的高低除了與酵母利用糖的能力有關外，還與橡實本身的化學成分等有關，如單寧可能會抑制酵母活力，從而降低淀粉的利用率。殘還原糖含量越低，表明該種橡實被酵母轉化為生物乙醇越多，一些抑菌成分對淀粉糖化和酵母利用糖的影響越小。由圖3可知，4種橡實發(fā)酵后醪液殘還原糖含量有顯著性差異(P＜0.05)，其中錐栗與茅栗的發(fā)酵醪液殘還原糖含量沒有顯著性差異(P＞0.05)，但與栓皮櫟與多脈青岡相比存在顯著性差異(P＜0.05)，由低到高依次為：錐栗、茅栗＜多脈青岡＜栓皮櫟。4種橡實發(fā)酵后醪液殘還原糖含量大小順序與它們的單寧含量具有一致性。

圖3 4種橡實發(fā)酵后醪液殘還原糖含量比較Fig.3 Comparison of reducing sugar contents among fermented mashes from 4 varieties of acorn starches

2.2.3 4種橡實發(fā)酵后淀粉利用率的比較

圖4 4種橡實發(fā)酵后淀粉利用率的比較Fig.4 Comparison of starch utilization rates among fermented mashes from 4 varieties of acorn starches

由圖4可知，發(fā)酵72h末，4種橡實品種的淀粉利用率不同，其中茅栗與錐栗在淀粉利用率方面無顯著性差異(P＞0.05)，但顯著高于栓皮櫟和多脈青岡(P＜0.05)。栓皮櫟和多脈青岡的淀粉利用率均非常低。栓皮櫟和多脈青岡雖然淀粉含量較高，但淀粉利用率低，由此也可初步判斷，錐栗和茅栗相對而言更適合生產生物乙醇[9]。

2.3 不同菌種對茅栗發(fā)酵性能的比較

以茅栗為淀粉原料，工業(yè)中常用的5種酵母(包括安琪耐高溫高活性干酵母、丹寶利活性干酵母、K字酵母菌株、南陽五號酵母(1300)、南陽混合酵母(1308)等5種)為發(fā)酵菌株，比較它們的發(fā)酵性能，以便選出最適合橡實淀粉發(fā)酵的酵母菌種[10-12]。

稱取5份過80目篩的茅栗淀粉50g，按料液比1:2.5加水調漿，加入200U/g的糖化酶，在250mL三角瓶中混合均勻，分別接入體積分數10%經過活化或擴大培養(yǎng)后的5種酵母菌株，在34℃條件下恒溫發(fā)酵。發(fā)酵后期，每隔12h分別測定醪液的酒精體積分數、殘還原糖含量[13]。

2.3.1 5種酒精酵母發(fā)酵后茅栗醪液酒精體積分數的比較

圖5 5種酒精酵母發(fā)酵后的茅栗醪液酒精體積分數比較Fig.5 Comparison of alcohol contents of fermented Castanea seguinii Dode mashes by 5 species of yeast

在相同原料和相同的條件下發(fā)酵，茅栗發(fā)酵醪液的酒精體積分數能直接反映淀粉的利用率和菌株的產酒性能。從圖5可看出，5種酒精酵母在發(fā)酵時間不超過36h時產酒速度沒有顯著性差異(P＞0.05)。當超過48h后，5種酵母發(fā)酵性能存在顯著性差異(P＜0.05)，安琪耐高溫高活性干酵母、丹寶利活性干酵母、南陽混合酵母(1308)的產酒性能具有明顯優(yōu)勢，安琪耐高溫高活性干酵母、丹寶利活性干酵母、南陽混合酵母(1308)在48h時即可達到南陽五號酵母(1300)在72h時的酒精體積分數，K字酵母產酒速度最慢。60h后，安琪耐高溫高活性干酵母的酒精體積分數超過南陽混合酵母(1308)，72h時，安琪耐高溫高活性干酵母、南陽混合酵母(1308)明顯優(yōu)于其他3種菌種。

2.3.2 5種酒精酵母發(fā)酵后醪液殘還原糖含量的比較

圖6 5種酒精酵母發(fā)酵后茅栗醪液殘還原糖含量的比較Fig.6 Comparison of residual sugar contents of fermented Castanea seguinii Dode mashes by 5 species of yeast

殘還原糖含量越低，表明原料利用越充分[14]。由圖6可知，各菌種發(fā)酵72h后醪液殘還原糖含量存在顯著性差異(P＜0.05)，其中K字酵母和南陽五號酵母(1300)的發(fā)酵醪液殘還原糖含量較低，而安琪耐高溫高活性干酵母、丹寶利活性干酵母、南陽混合酵母(1308)的殘還原糖含量較低。

3 結 論

研究結果表明，錐栗和茅栗相對而言更適合生產生物乙醇。茅栗和錐栗發(fā)酵后醪液酒精體積分數、醪液殘還原糖含量和淀粉利用率方面均無顯著性差異(P＞0.05)，且明顯優(yōu)于栓皮櫟與多脈青岡(P＜0.05)。通過對安琪耐高溫活性干酵母、丹寶利活性干酵母、K字酵母、南陽五號酵母(1300)、南陽混合酵母(1308)等5種酵母發(fā)酵性能的比較可知，安琪耐高溫高活性干酵母和南陽混合酵母(1308)發(fā)酵后醪液酒精體積分數和醪液殘還原糖含量方面相對于另外3種酒精酵母具有顯著優(yōu)勢(P＜0.05)，安琪耐高溫高活性干酵母和南陽混合酵母(1308)是橡實淀粉生物乙醇化的最優(yōu)菌種。

隨著世界化石能源的日益匱乏，開發(fā)綠色可持續(xù)利用的能源成為了緊迫任務。以橡實淀粉為原料生產燃料乙醇可作為我國能源供應多元化戰(zhàn)略的有益補充[15]。因此，研究橡實淀粉生物乙醇化橡實品種和菌種的篩選具有一定的現實意義。

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Screening of Acorn Varieties and Yeast Strains for Bio-ethanol Production

TIAN Yu-feng，LI An-ping*，XIE Bi-xia，DING Yan-peng，CUI Fu-gui (College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

In the present study, comparative investigations on the nutritional composition and fermentability of acorn kernels from 12 varieties and the adaptability of 5 species of yeast towards the fermentation of Castanea seguinii Dode starch were carried out. The results showed that among 12 varieties of acorn, Castanea seguinii Dode, Quercus variabilis Blume, Cyclobalanopsis multinervis and Castanea henryi contained higher starch content and starch yield per plant but less tannin. Fermented mashes from Castanea henryi and Castanea seguinii Dode starches exhibited significantly (P ＜ 0.05) higher alcohol content and starch utilization rate but significantly (P ＞ 0.05) lower reducing sugar content when compared to fermented mashes from Quercus variabilis Blume and Cyclobalanopsis multinervis starches. Angel high tem,p,erature active dry yeast and Nanyang yeast 1308 had a significant (P ＜ 0.05) advantage over Danbaoli high active dry yeast,“K” yeast and Nanyang yeast 1300 in terms of alcohol content and residual sugar content in fermented mash, thereby proving perfect strains for bio-ethanol production from acorn.

bio-ethanol production；acorn varieties；strain；screening

TQ223.122

A

1002-6630(2011)07-0207-04

2010-07-27

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(200804033)；湖南省科技計劃項目(2010NK3040)

田玉峰(1986—)，男，碩士研究生，主要從事林副產品深加工研究。E-mail：tyf2880211@163.com

*通信作者：李安平(1967—)，男，教授，博士，主要從事林副產品深加工研究。E-mail：lianpinglianping@yahoo.com.cn