丁利君，張敏玲

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

鯉魚蛋白控制酶解及其酶解產(chǎn)物抗氧化研究

丁利君，張敏玲

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

以鯉魚為原料，利用枯草桿菌蛋白酶對鯉魚蛋白進行控制酶解，制取富含多肽的酶解液，并對其抗氧化性進行研究。以水解度、多肽含量、氨基酸含量、抗氧化性為指標(biāo)，對自由基清除率評價其抗氧化性。通過單因素試驗，研究酶解溫度、pH值、酶用量、酶解時間、料液比等因素對酶解過程的影響，并進行三元二次回歸設(shè)計，對最佳的酶解工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明：以枯草桿菌蛋白酶對鯉魚蛋白進行酶解，最佳工藝參數(shù)為酶解溫度62℃、酶用量100U/g、料液比1:2(g/mL)、pH7.0、酶解4h。此條件下，酶解液多肽含量為0.704mg/mL，對羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別為73.41%和59.78%，酶解液有很好的抗氧化性。

鯉魚；多肽；酶解；抗氧化性

我國鯉魚分布廣泛，產(chǎn)量高，是我國主要的經(jīng)濟魚類之一。鯉魚是原產(chǎn)亞洲的溫帶性淡水魚，營養(yǎng)價值較高[1]。但鯉魚大多用作家庭烹飪或初級加工，特別是廣東的鯉魚價格低廉，有必要進一步提高其利用價值，提高其附加值[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，活性多肽有比蛋白質(zhì)、氨基酸更多的生理活性[3-4]。Erdmann等[5]對食源性生物活性肽在降低心血管疾病的風(fēng)險可能發(fā)揮的作用進行了綜述，對乳源性生物活性肽、酪蛋白生物活性肽的研究比較多[6-7]，近年來對水產(chǎn)生物活性肽的研究也越來越多[8-9]?；钚噪木哂腥梭w代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有抗氧化[10]、促進免疫、激素、酶抑制劑、抗菌、抗病毒、降血脂等作用，食用安全性高，是極具發(fā)展前景的功能因子。本實驗以鯉魚為原料，采用生物酶解技術(shù)，利用枯草桿菌蛋白酶對鯉魚蛋白進行控制酶解，研究酶解過程中水解度、多肽含量與其抗氧化性的關(guān)系，以期為鯉魚的深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鯉魚購于廣州番禺市場。

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；KDC-40低速離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

枯草桿菌蛋白酶(酶活20000U/mL) 美國諾維信公司；三氯乙酸 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；雙縮脲試劑、茚三酮顯色劑、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠；鄰苯三酚(分析純) 天津福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 原材料預(yù)處理

魚經(jīng)去頭、尾、內(nèi)臟后，清洗、切塊、滅酶、異丙醇脫脂、瀝干，粉碎成碎魚肉，包裝、冷藏(－5℃)備用[11]。

1.2.2 酶解液制備方法

稱取一定量脫脂鯉魚碎魚肉，按一定比例加蒸餾水，調(diào)魚糜液pH值，加酶液恒溫酶解，滅酶、冷卻、離心(4000r/min、15min)，得酶解液，備用[11]。

1.2.3 總氮、可溶性蛋白的測定

總氮測定采用凱氏定氮法[12]，可溶性蛋白的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[13]。

1.2.4 多肽含量的測定

采用雙縮脲法[14]。取2.5mL酶解溶液，加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸，振蕩混合均勻，靜置10min，在4000r/min離心15min，將上清液用5%三氯乙酸定容到50mL。取6.0mL上述溶液置另一試管中，加入雙縮脲試劑4.0mL，混勻，靜置10min，2000r/min離心10min，取上清液于540nm波長處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算樣品中多肽含量。

1.2.5 氨基氮含量及水解度的測定

氨基氮含量的測定采用茚三酮法[15]。取酶解液稀釋100倍，取0.40mL稀釋液于試管中，加入1.60mL蒸餾水，1.00mL顯色劑，混勻，沸水浴加熱15min；同時作空白實驗，冷卻，加入5.00mL 40%乙醇溶液混勻，放置15min后測定570nm處的吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶解液的氨基氮含量。

酶解溶液水解度DH的計算方法：DH/%=[氨基氮含量/總氮含量×6.25－0.33]/7.8×100

1.2.6 鯉魚蛋白酶解液對·OH清除率的測定

[16]方法進行測定。

1.2.7 鯉魚蛋白酶解液對超氧陰離子自由基(O2－·)清除作用

采用鄰苯三酚氧化法進行測定[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時間對鯉魚蛋白酶解效果的影響

稱取脫脂鯉魚碎魚肉，按料液比(即碎魚肉與水之比，g/mL)為1:2加入蒸餾水，調(diào)pH7.0，加酶量E/S為100U/g，于65℃酶解不同時間，滅酶、冷卻、離心(4000r/min，15min)，測定上清液即酶解液的多肽含量、水解度和對自由基的清除率(圖1)，研究酶解時間對鯉魚蛋白酶解效果的影響。結(jié)果表明，用枯草桿菌蛋白酶水解鯉魚蛋白，隨著酶解時間的延長，魚糜蛋白的水解度逐漸增加；酶解時間在4h前，酶解液中多肽含量、對自由基的清除率都隨著酶解的進行而加大，但酶解時間超過4h，多肽含量隨著水解度的加大而逐漸下降，對自由基的清除作用也隨之下降。這是因為隨酶解時間的延長，多肽被繼續(xù)水解成氨基酸，酶解液對自由基的清除作用隨著酶解液中多肽含量的減少而降低，即多肽含量與對自由基的清除率有相關(guān)性，說明對自由基的清除作用主要來源于酶解液中的多肽。

圖1 酶解時間對酶解效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis, polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

2.2 酶用量對鯉魚蛋白酶解效果的影響

圖2 酶用量對酶解效果的影響Fig.2 Effect of enzyme dose on degree of hydrolysis, polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

稱取脫脂鯉魚碎魚肉，按料液比1:2加入蒸餾水，調(diào)pH7.0，分別不同酶量，65℃酶解4h后滅酶，冷卻、離心(4000r/min、15min)、測定，研究酶用量對鯉魚蛋白酶解效果的影響。從圖2可以看出，酶用量為100U/g時，酶解液中多肽的含量最高。當(dāng)酶用量過少時，底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶的濃度，反應(yīng)系統(tǒng)中酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，即v=k[E]。當(dāng)酶用量過大時，酶解液中的蛋白質(zhì)、多肽與酶作用的機會大大增加，分解為游離氨基酸。鯉魚蛋白酶解液對·OH和O2－·清除率隨酶解液多肽的增加而增大。加酶量在100U/g以上時，對水解度影響很小。

2.3 料液比對鯉魚蛋白酶解效果的影響

稱取脫脂鯉魚碎魚肉，按不同料液比加入蒸餾水，調(diào)pH7.0，加酶量100U/g，65℃酶解4h，滅酶、冷卻、離心，得酶解液，測多肽含量、水解度、抗氧化性，研究料液比對鯉魚蛋白酶解效果的影響。從圖3可以看出，料液比在1:2時，鯉魚蛋白酶解液中的多肽含量最高，對·OH和O2－·清除能力最強，清除率達(dá)到62.10%和49.71%。

圖3 料液比對酶解效果的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on degree of hydrolysis,polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

2.4 pH值對鯉魚蛋白酶解效果的影響

圖4 酶解pH值對酶解效果的影響Fig.4 Effect of pH value on on degree of hydrolysis, polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

稱取脫脂鯉魚碎魚肉，按料液比1:2加入蒸餾水，調(diào)節(jié)不同pH值，加酶量100U/g，65℃酶解4h，滅酶、冷卻、離心，得酶解液，測多肽含量、水解度、抗氧化性，研究pH值對鯉魚蛋白酶解效果的影響。圖4結(jié)果表明，pH7.0時，酶解液的多肽含量最高，對自由基清除率最大，可見枯草桿菌蛋白酶作用于鯉魚蛋白的最適pH值是7.0。

2.5 溫度對鯉魚蛋白酶解效果的影響

圖5 酶解溫度對酶解效果的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis,polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

稱取脫脂鯉魚碎魚肉，按料液比1:2加入蒸餾水，調(diào)pH7.0，加酶量100U/g，在不同溫度酶解4h，滅酶、冷卻、離心，測定，研究酶解溫度對鯉魚蛋白酶解效果的影響。圖5結(jié)果表明，65℃時的水解度最大，對羥自由基的清除率達(dá)到了最高值，酶解效果最佳，65℃是枯草桿菌蛋白酶作用于鯉魚蛋白的最適酶解溫度。

2.6 三元二次旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計及結(jié)果分析

考慮到酶解過程受到多因素之間的相互影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上，進行三元二次旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計，因子水平編碼表見表1。根據(jù)三因子二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果，用SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行回歸分析，對鯉魚蛋白質(zhì)的酶解條件進行優(yōu)化。

表1 因素水平編碼表Table 1 Coded factors and levels in ternary quadratic regression rotation design

表2 鯉魚蛋白控制酶解旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計及其結(jié)果Table 2 Ternary quadratic regression rotation design scheme and corresponding experimental results

采用SPSS軟件，對表2結(jié)果進行分析[18]。表3結(jié)果表明，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.813，表明其方程的擬合度良好。方差分析F值的顯著性概率為0.011小于0.05，所以回歸達(dá)到顯著水平，說明酶解液中多肽含量和其各因素之間存在顯著的回歸關(guān)系，試驗設(shè)計方案正確，回歸方程式有意義，回歸方程為y=0.5－0.0882x1－0.0506x3。由此方程得出，采用枯草桿菌蛋白酶酶解鯉魚蛋白，各因素的最優(yōu)水平為酶解溫度62℃、酶用量100U/g、料液比1:2、pH7.0、酶解4h。在此條件下，測得酶解液中多肽含量為0.704mg/mL，水解度為55.43%，對羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別為73.41%和59.78%。

表3 旋轉(zhuǎn)回歸試驗結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results generated by ternary quadratic regression rotation design

3 結(jié) 論

綜上所述，采用枯草桿菌蛋白酶對鯉魚蛋白進行酶解，制備富含多肽的酶解液，酶解最佳條件為酶解溫度62℃、酶用量100U/g、料液比1:2、pH7.0、酶解4h，此條件下，測得酶解液中多肽含量為0.704mg/mL，水解度為55.43%，對羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別為73.41%和59.78%。酶解液的多肽含量與其抗氧化活性有關(guān)。該實驗結(jié)果對鯉魚蛋白的深加工有參考利用價值。

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Controlled Hydrolysis of Carp Protein and Antioxidant Activity of Its Hydrolysate

DING Li-jun，ZHANG Min-ling
(College of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China)

Carp protein was hydrolyzed by subtilisin to prepare hydrolysate rich in peptides, and its antioxidant activity was investigated by free radical scavenging assay. The effects of the hydrolysis conditions temperature, pH, enzyme dosage, reaction time and solid-to-water ratio on degree of hydrolysis, polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals were examined in single factor experiments. Further, ternary quadratic regression rotation design was employed to optimize temperature, enzyme dose and solid-to-liquid ratio for maximizing polypeptide content. The results showed that the optimum values of temperature, pH, enzyme dosage, reaction time and solid-to-water ratio were 62 ℃, 7.0, 100 U/g, 4 h and 1:2 (g/mL). The polypeptide content in the resultant hydrolysate under these conditions was 0.704 mg/mL, and its scavenging rates against hydroxyl and superoxide anion free radicals were 73.41% and 59.78%, respectively,suggesting excellent antioxidant activity.

carp protein；hydrolysis；polypeptides；antioxidant activity

TS201.21

A

1002-6630(2011)08-0070-04

2010-06-09

廣東省科技計劃項目(2006B204010)；從化市科技計劃項目(從科2010B02-03)

丁利君(1965—)，女，教授，碩士，主要從事食品化學(xué)、食品加工研究。E-mail：ddddlj@gmail.com