侯進(jìn)慧，蔡 侃，鄭寶剛，曹玉朋，王清泉

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

蘆筍18S rDNA序列和分類分析

侯進(jìn)慧，蔡 侃，鄭寶剛，曹玉朋，王清泉

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

通過植物基因組提取方法對(duì)蘆筍的基因組DNA進(jìn)行提取，采用PCR方法對(duì)其18S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選后，獲得長(zhǎng)度為1684bp的 18S rDNA序列。將序列提交后，獲得GenBank數(shù)據(jù)庫基因登錄號(hào)GU217543。分析蘆筍18S rDNA的基因序列，確定蘆筍與百合目(Liliales)和天門冬目(Asparagales)的多種植物在分類上有很近的關(guān)系，從而對(duì)分子水平上蘆筍的分類有了進(jìn)一步的了解。

蘆筍；18S rDNA；分類

蘆筍(Asparagus officinalis L.)又名石刁柏、龍須菜、筍尖、文山竹、露筍，其嫩莖質(zhì)地細(xì)膩，纖維柔軟、風(fēng)味鮮美、能增進(jìn)食欲、幫助消化，是世界公認(rèn)的十大健康蔬菜之首。其資源豐富、價(jià)廉物美，且具有很好的藥理作用以及很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在最早的藥書《神農(nóng)本草經(jīng)》中將其列為“上品之上”，稱其久服輕身、益氣延年。有研究表明，其具有很好的抗突變、抗癌作用，能改善人體免疫功能，尤其對(duì)T細(xì)胞免疫水平起保護(hù)作用[1-3]。分析蘆筍分類地位和資源狀況，有利于深入了解其功能特性，推進(jìn)這種食品資源的開發(fā)。目前對(duì)蘆筍的遺傳基礎(chǔ)研究較少，尚未見針對(duì)其核糖體DNA(rDNA)的研究。rDNA是編碼核糖體RNA的基因，通過測(cè)定其序列可以鑒定物種同源性，確定其分類地位，掌握物種多樣性。目前，rDNA序列分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物分類、系統(tǒng)發(fā)育以及中藥材的鑒定中。比如，利用植物中藥材rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA堿基排序測(cè)定，可作為中藥材分子鑒定的標(biāo)記[4]。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)序獲得蘆筍18S rDNA序列，對(duì)蘆筍的分類進(jìn)行初步分析，為蘆筍資源分類研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以產(chǎn)自江蘇豐縣的蘆筍(Asparagus officinalis L.)作為實(shí)驗(yàn)材料。

PCR反應(yīng)引物合成試劑 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、T-載體、T4 DNA 連接酶、植物基因組提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 蘆筍基因組DNA的提取

使用無菌刀片將去皮并經(jīng)ddH2O清洗過的蘆筍切成條狀，以液氮研磨成粉末狀，采用植物基因組提取試劑盒提取蘆筍基因組DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，作為 PCR反應(yīng)模板。

1.3 蘆筍18S rDNA序列克隆測(cè)序

用于擴(kuò)增18S rDNA 序列的引物為[5-6]：F：5′-GTA GTCATATGCTTGTCTC-3′和 R：5′-TCCGCAG GTTCACCTACGGA-3′。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性60s，56℃退火60s，72℃延伸2min，反應(yīng)25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將18S rDNA序列與T-載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 蘆筍的分類分析

將蘆筍18S rDNA序列提交NCBI網(wǎng)站，獲得登錄號(hào)。使用BLAST程序在GeneBank中進(jìn)行序列比對(duì)，獲得與蘆筍序列相近物種的18S rDNA序列，利用DNAMAN程序進(jìn)行分析。通過堿基序列比對(duì)和相似度分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得蘆筍與相關(guān)物種的分類關(guān)系[7-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍18S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果

將提取的基因組DNA 與擴(kuò)增出的18S rDNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，所提取DNA的質(zhì)量合格，PCR方法獲得的18S rDNA無雜帶，特異性強(qiáng)，可以進(jìn)行克隆、測(cè)序(圖1A)。使用限制性內(nèi)切酶PstI將18S rDNA與T-載體pUCm-T(2773bp)的重組質(zhì)粒進(jìn)行切割后可見18S rDNA插入序列(圖1B)，篩選出陽性克隆。

圖1 蘆筍18S rDNA克隆的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of amplification products Asparagus officinalis L. 18S rDNA

2.2 蘆筍18S rDNA序列

將克隆的蘆筍18S rDNA序列送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，通過雙向測(cè)序，利用軟件進(jìn)行序列拼接，最終獲得了蘆筍的長(zhǎng)度為1684bp的 18S rDNA序列(圖2)。將該序列登錄到GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲得基因登錄號(hào)：GU217543。

圖2 蘆筍18S rDNA序列Fig.2 Sequence of Asparagus officinalis L. 18S rDNA

2.3 蘆筍分類學(xué)分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索基因數(shù)據(jù)信息，獲得了與蘆筍18S rDNA序列相近的19個(gè)物種的18S rDNA序列，利用DNAMAN程序，對(duì)相關(guān)物種的18S rDNA序列進(jìn)行分析。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，獲得蘆筍與相關(guān)物種的分類關(guān)系。序列分析顯示，蘆筍與百合目(Liliales)的百合科(Liliaceae)和天門冬目(Asparagales)的多種植物序列聚類在一起，它們?cè)诜诸惿嫌泻芙年P(guān)系。

圖3 根據(jù)蘆筍的18S rDNA序列和GenBank相關(guān)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining tree based on 18S rDNA sequence of Asparagus officinalis L. and its close relatives in GenBank

3 討 論

在傳統(tǒng)的農(nóng)作物資源分析和系統(tǒng)分類學(xué)的研究中，一般通過形態(tài)解剖學(xué)、孢粉學(xué)和生理生化等特征進(jìn)行表型分析，并基于表型分析結(jié)果進(jìn)行物種資源分類，其方法有一定的局限性，而采用分析作物DNA中的分子信息，不僅信息量大，可以提高農(nóng)作物系統(tǒng)分類在分子水平上的直接證據(jù)，而且可以從分子水平上認(rèn)識(shí)物種分化的內(nèi)在原因和物質(zhì)基礎(chǔ)[9-10]。因此，利用諸如rDNA等一些分子序列進(jìn)行農(nóng)作物資源分析，是當(dāng)今農(nóng)業(yè)資源分析研究的一個(gè)熱點(diǎn)和趨勢(shì)[11]。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)序獲得了蘆筍18S rDNA的基因序列。序列分析結(jié)果顯示，蘆筍與百合目(Liliales)的百合科(Liliaceae)和天門冬目(Asparagales)的多種植物在分類上有很近的關(guān)系。人們利用傳統(tǒng)分類學(xué)方法，對(duì)蘆筍的分類是：被子植物門(Magnoliophyta)，單子葉植物綱(Liliopsida)，百合目(Liliales)，百合科(Liliaceae)，天門冬屬(Asparagus Linn.)，蘆筍(Asparagus officinalis L.)。

本實(shí)驗(yàn)利用18S rDNA基因序列分析蘆筍的分類學(xué)地位，與傳統(tǒng)分類學(xué)的結(jié)果是相近的。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出，蘆筍與天門冬目的親密關(guān)系。通過圖3 可以看出，系統(tǒng)發(fā)育樹中18個(gè)物種都是天門冬目的，而百合目的只有一個(gè)物種Luzuriaga latifolia(AF233091)。這說明百合目和天門冬目在分類學(xué)上的關(guān)系很密切，通過18S rDNA基因序列分析很難將這兩個(gè)目的物種截然分開，這還需要增加一些基因序列的分析，才能對(duì)蘆筍的分類地位進(jìn)行精確的分子分析。

[1] 湯新慧, 高靜. 蘆筍汁的抗突變作用[J]. 南京大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版,2001, 37(5): 569-573.

[2] 凌莉, 李志勇. 果蔬中的功能因子[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 906-909.

[3] 郭兵, 張春林, 孟金玲, 等. 蘆筍對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1995, 20(4): 285-287.

[4] 李萍, 蔡朝暉, 邢俊波. 5S rRNA基因間序列變異用于金銀花藥材道地性研究初探[J]. 中草藥, 2001: 32(9): 834-836.

[5] 吳耀生, SLOCOMBE S. 中藥三七根核糖體18S rRNA基因的序列分析[J]. 中草藥, 2001, 32(12): 11-16.

[6] 楊澤民, 章群, 謝數(shù)濤, 等. 鞭金藻18S rRNA基因序列分析與分類學(xué)意義[J]. 水利漁業(yè), 2008, 28(2): 13-15.

[7] 侯進(jìn)慧, 劉全德, 高明俠, 等. 胡蘿卜表面產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌初步鑒定分析[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(5): 233-236.

[8] 侯進(jìn)慧. 牛蒡表面產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離鑒定[J]. 食品工業(yè)科技,2010, 31(2): 181-182; 207.

[9] SCHAAL B A, LEARN G H, Jr. Ribosomal DNA variation within and among plant population[J]. Ann Missouri Bot Gard, 1988, 75(10):1207-1216.

[10] APPLE R, DVORAK J. The wheat ribosomal DNA spacer region: ITS structure and varuation in population and among species[J]. Theor Appl Genet,1982, 63(4): 337-348.

[11] 劉志文, 韓旭, 趙明輝, 等. 核核糖體DNA在植物系統(tǒng)發(fā)育中的應(yīng)用與研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(9): 3561-3562.

Sequence and Classification Analysis of 18S rDNA in Asparagus officinalis L.

HOU Jin-hui，CAI Kan，ZHENG Bao-gang，CAO Yu-peng，WANG Qing-quan
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

In this study, the genomic DNA of Asparagus officinalis L. was extracted by plant genome extraction method, and its fragment of 18S rDNA was amplified by PCR method, followed by ligation, transformation, and screening. An 18S rDNA fragment of 1684 bp in length was sequenced. The accession number of the sequence in Genbank was GU217543. The gene sequence of Asparagus officinalis L. was analyzed. The results indicated that Asparagus officinalis L. had close genetic relationship with the species of Liliales and Asparagales. Based on these investigations, the classification of Asparagus officinalis L. has been further understood at the molecular level.

Asparagus officinalis L.；18S rDNA；classification

S59.023

A

1002-6630(2011)05-0221-03

2010-05-27

徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(XZZD0924)；徐州工程學(xué)院引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目；徐州工程學(xué)院科研項(xiàng)目(XKY2008110)；

江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2010-971)

侯進(jìn)慧(1980—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樯锕こ獭-mail：houjinhui0@126.com