張 勇，田 原，叢 威*

(1.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所，北京 100190；2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100190；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

玉米漿調(diào)節(jié)乳酸發(fā)酵基質(zhì)氧化還原電位參數(shù)的研究

張 勇1,2，田 原3，叢 威1,*

(1.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所，北京 100190；2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100190；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

乳酸厭氧發(fā)酵過(guò)程中缺乏有效的監(jiān)控參數(shù)，難以了解菌體在發(fā)酵過(guò)程中生理狀態(tài)的變化情況。氧化還原電位(oxidoreduction potential，ORP)對(duì)乳酸發(fā)酵有直接的影響，能靈敏地反映發(fā)酵體系狀態(tài)的變化。以O(shè)RP的變化規(guī)律為依據(jù)，考察玉米漿的添加量和添加時(shí)間對(duì)乳酸發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，最佳玉米漿添加量為體積分?jǐn)?shù)0.5%，最適添加時(shí)間為30h，即ORP開(kāi)始回升時(shí)。玉米漿的添加有效調(diào)節(jié)了發(fā)酵后期的碳氮比，并維持了有利于乳酸合成的還原性環(huán)境，乳酸產(chǎn)量提高了20%。結(jié)果顯示，ORP可以作為乳酸代謝的調(diào)控參數(shù)，而玉米漿可以調(diào)節(jié)發(fā)酵醪的ORP。

乳酸；pH值反饋補(bǔ)料；氧化還原電位；玉米漿

乳酸又名2-羥基丙酸，是世界公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，在食品保存、制藥、皮革及紡織行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用[1-3]。發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸可以采用根霉好氧發(fā)酵，也可以采用細(xì)菌厭氧發(fā)酵[4]。但目前對(duì)細(xì)菌厭氧發(fā)酵乳酸過(guò)程缺乏有效的監(jiān)控參數(shù)。

近年來(lái)，氧化還原電位(ORP)在厭氧發(fā)酵中的應(yīng)用研究越來(lái)越多。Sridhar等[5-6]的研究表明，菌體所處的微觀環(huán)境對(duì)菌體的生長(zhǎng)和菌體的代謝流量具有顯著的影響，每一株菌株都有一個(gè)合適的氧化還原電位。Riondet等[7-8]用氧化還原電位表征菌體生長(zhǎng)的微觀環(huán)境，并通過(guò)通入氮?dú)狻錃饧疤砑覰aHB4研究氧化還原電位對(duì)菌體的影響。黃志華等[9]利用氧化還原電位調(diào)控基因工程菌生產(chǎn)1,3-丙二醇。鄭繼岱等[10]研究了氧化還原電位對(duì)乳酸發(fā)酵過(guò)程的影響機(jī)理，并通過(guò)向發(fā)酵罐中脈沖通氣將發(fā)酵體系的氧化還原電位控制在合適的范圍內(nèi)以提高乳酸產(chǎn)量。

向體系中添加化學(xué)試劑可能對(duì)菌體產(chǎn)生一定的毒害作用[11]，而通入氮?dú)?、氫氣控制氧化還原電位會(huì)大量增加生產(chǎn)成本[12-13]，不利于工業(yè)放大生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)以氧化還原電位為監(jiān)控參數(shù)，考察其與乳酸發(fā)酵體系中各參數(shù)間的聯(lián)系，并以此為依據(jù)添加適量的玉米漿以調(diào)節(jié)乳酸發(fā)酵體系的碳氮比和氧化還原電位，從而提高乳酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

乳酸菌(Lactobacillus lactis-11)由山東大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

蛋白胨、酵母粉 英國(guó)Oxoid公司；乳酸鋰標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Merck公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純。

液體種子和發(fā)酵培養(yǎng)基都為MRS培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基：MRS中添加2%的瓊脂粉。MRS培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[14]配制。

1.2 儀器與設(shè)備

5L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40生物傳感分析儀 山東生物科學(xué)研究院；723N可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HPLC-1200高效液相色譜-1200系統(tǒng) 美國(guó)Agilent公司；搖床上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司；DELTA 320 pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵條件

菌種從斜面轉(zhuǎn)入裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，42℃、50r/min培養(yǎng)12h，體積分?jǐn)?shù)10%的接種量轉(zhuǎn)入5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵過(guò)程中不通入空氣，發(fā)酵溫度為42℃，pH 6.0，轉(zhuǎn)速100r/min保持發(fā)酵液混合均勻，每4h取樣一次，稀釋20倍測(cè)定OD620nm，8000r/min離心10min取上清液測(cè)定乳酸質(zhì)量濃度。

1.3.2 pH值反饋控制補(bǔ)料分批發(fā)酵

pH值反饋控制發(fā)酵本實(shí)驗(yàn)室已有報(bào)道[15-16]。發(fā)酵液初始糖質(zhì)量濃度為10g/L，用6mol/L的氨水調(diào)節(jié)pH值，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降到5g/L時(shí)，開(kāi)始采用pH值反饋方法補(bǔ)料，補(bǔ)料液由葡萄糖和氨水混合組成，其質(zhì)量濃度分別為389g/L和69g/L，葡萄糖與NH3氣質(zhì)量比為5.7:1，發(fā)酵結(jié)束前4h，改用6mol/L的氨水控制pH值至發(fā)酵結(jié)束。

1.4 玉米漿調(diào)控實(shí)驗(yàn)

分別考察玉米漿的添加量和添加時(shí)間對(duì)乳酸發(fā)酵的影響。首先，在ORP值開(kāi)始回升時(shí)添加不同量的玉米漿，添加量分別為體積分?jǐn)?shù)0.2%、0.5%、1%、1.5%，確定玉米漿的最適添加量；然后，分別考察在0、20、30h添加最適量的玉米漿時(shí)對(duì)乳酸發(fā)酵的影響，確定最適添加時(shí)間。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定

采用SBA-40生物傳感分析儀測(cè)定。測(cè)定前，發(fā)酵液樣品先經(jīng)8000r/min離心10min，取上清液并適當(dāng)稀釋?zhuān)改y(cè)定儀定標(biāo)完成后，用進(jìn)樣針吸取25μL進(jìn)樣，測(cè)得的數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即為發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.5.2 乳酸質(zhì)量濃度測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]采用HPLC法測(cè)定。

1.5.3 菌體密度測(cè)定

利用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)620nm處測(cè)定發(fā)酵基質(zhì)的吸光度，然后轉(zhuǎn)換成菌體干質(zhì)量[15]。

1.5.4 氧化還原電位測(cè)定

采用Mettler Toledo氧化還原電極測(cè)定[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初始糖質(zhì)量濃度條件下乳酸發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)的變化趨勢(shì)

為了解乳酸發(fā)酵過(guò)程中ORP的變化規(guī)律以及與其他參數(shù)間的聯(lián)系，分別考察不同初始糖質(zhì)量濃度條件下，采用pH值反饋補(bǔ)料方式的分批補(bǔ)料發(fā)酵中ORP與其他參數(shù)間的關(guān)系。

圖1 不同初始糖質(zhì)量濃度條件下乳酸發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)的變化趨勢(shì)Fig.1 Changes in several parameters during lactic acid fermentation process with various initial glucose concentrations

由圖 1 可知，不同初始糖質(zhì)量濃度條件下，利用pH值反饋控制補(bǔ)糖的方法能將乳酸發(fā)酵過(guò)程中的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度維持在 5g/L左右，穩(wěn)定的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度消除了因底物濃度波動(dòng)較大引起的其他參數(shù)的變化，可以更真實(shí)的考察ORP值與其他參數(shù)間的變化規(guī)律。在發(fā)酵的前10h，OR P 值急劇下降，隨后逐漸進(jìn)入平穩(wěn)期，穩(wěn)定在－ 390mV左右，30h后，ORP值開(kāi)始回升。發(fā)酵開(kāi)始后，乳酸產(chǎn)率和菌體干質(zhì)量濃度迅速增加，30h 后，隨著ORP值的回升，菌體干質(zhì)量濃度逐漸趨于平穩(wěn)，而乳酸產(chǎn)率則迅速下降。這可能是多個(gè)因素造成的：1)隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸質(zhì)量濃度增加，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸都受到抑制；2)隨著ORP值的回升，導(dǎo)致細(xì)胞生理狀態(tài)發(fā)生改變，特別是輔酶因子NADH/NAD+的比值減小，不利于乳酸生產(chǎn)[18]；3)在發(fā)酵中后期，由于碳源一直維持在穩(wěn)定的水平，但氮源因?yàn)榫w生長(zhǎng)不斷減少，造成碳氮比失衡。因此在發(fā)酵中后期，根據(jù)ORP值的變化情況，補(bǔ)加一定量的氮源可能會(huì)有利于維持穩(wěn)定的ORP環(huán)境和菌體的生理狀態(tài)，從而提高乳酸產(chǎn)量。

2.2 玉米漿添加量對(duì)乳酸發(fā)酵的影響

玉米漿營(yíng)養(yǎng)豐富，價(jià)格低廉，是發(fā)酵工業(yè)上常用的有機(jī)氮源，以O(shè)RP值作為反饋信號(hào)，在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加適量的玉米漿，以達(dá)到提高乳酸產(chǎn)量的目的。

圖2 添加不同量的玉米漿條件下乳酸發(fā)酵過(guò)程中菌體產(chǎn)率和乳酸產(chǎn)率以及ORP的比較Fig.2 Comparison of cell growth rate (A), lactic acid productivity (B)and ORP (C) during lactic acid fermentation process at the condition of corn syrup with various addition amounts

由圖2可見(jiàn)，如果不添加玉米漿，30h以后，ORP開(kāi)始有明顯回升，菌體增長(zhǎng)速率為負(fù)值，即生物量出現(xiàn)下降，另外乳酸合成速率持續(xù)減小；而添加玉米漿后，ORP則回升不明顯，生物量基本維持穩(wěn)定，乳酸合成速率下降放緩，進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期(除添加0.2%的玉米漿以外)。

表1 不同玉米漿添加量下乳酸發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)對(duì)比Table 1 Comparison of several parameters during lactic acid fermentation process with various amounts of corn syrup addition

由表1可見(jiàn)，隨著玉米漿添加量的增加，對(duì)生物量影響不大，而最大乳酸質(zhì)量濃度卻隨之增加，但當(dāng)玉米漿的添加量大于0.5%時(shí)，對(duì)進(jìn)一步提高乳酸產(chǎn)量的作用不顯著。因此，綜合考慮添加成本和效果，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%為最適的玉米漿添加量。

從表1還可看出，與不添加玉米漿的情況相比，添加0.2%的玉米漿后，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率反而降低了，而生物量變化較小，這說(shuō)明乳酸菌的代謝流發(fā)生了改變，但之后葡萄糖的轉(zhuǎn)化率隨玉米漿添加量的增加而增加，這可能是由于玉米漿的添加，一方面調(diào)節(jié)了碳氮比，另一方面改變了ORP值，維持還原性環(huán)境有利于乳酸合成，從而在一定程度上抵消了乳酸菌在更高乳酸環(huán)境中受到的抑制作用，提高了葡萄糖的轉(zhuǎn)化率。

從ORP值的變化趨勢(shì)看，ORP值雖然反映的是體系的氧化還原物質(zhì)的濃度，但這些物質(zhì)濃度會(huì)對(duì)菌體的生理狀態(tài)及細(xì)胞內(nèi)的代謝流產(chǎn)生影響[10]，因此將ORP值作為乳酸發(fā)酵體系的反饋信號(hào)，能夠迅速反映出菌體產(chǎn)酸能力的變化。

2.3 玉米漿添加時(shí)間對(duì)乳酸發(fā)酵的影響

圖3 不同時(shí)間添加0.5%玉米漿條件下乳酸發(fā)酵過(guò)程中菌體產(chǎn)率和乳酸產(chǎn)率以及ORP的比較Fig.3 Comparison of cell growth rate (A), lactic acid productivity (B)and ORP (C) during lactic acid fermentation process with corn syrup addition at 0.5%

為了確定添加玉米漿的最佳時(shí)間，在乳酸發(fā)酵過(guò)程中ORP值變化較明顯的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)添加體積分?jǐn)?shù)0.5%玉米漿，考察其對(duì)乳酸發(fā)酵的影響。

由圖3可見(jiàn)，在發(fā)酵30h之內(nèi)，于0h添加玉米漿能提高菌體產(chǎn)率，30h之后，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)添加玉米漿的情況基本趨于相同；乳酸產(chǎn)率方面，0h添加玉米漿條件下，20h乳酸產(chǎn)率開(kāi)始急劇下降；20h添加玉米漿后，乳酸產(chǎn)率到32h才開(kāi)始下降；而于30h添加玉米漿后，32～45h乳酸產(chǎn)率進(jìn)入平臺(tái)期，延緩了乳酸產(chǎn)率的下降；ORP方面，0h添加玉米漿時(shí)，發(fā)酵后期ORP有明顯回升，而在20h和30h添加玉米漿時(shí)ORP回升相對(duì)較小，這表明在中后期添加玉米漿能更好地維持還原性O(shè)RP環(huán)境。

表2 不同時(shí)間添加0.5%的玉米漿條件下乳酸發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)對(duì)比Table 2 Comparison of several parameters during lactic acid fermentation process when 0.5% corn syrup was added at various time points

由表2可知，在0h和20h添加玉米漿，生物量增加了，但乳酸質(zhì)量濃度卻低于在30h添加玉米漿的情況，相比于不添加玉米漿時(shí)的乳酸產(chǎn)量96.3g/L，30h添加玉米漿條件下乳酸產(chǎn)量提高了近20%。此外，在0h添加玉米漿后，后期ORP值仍然回升較明顯，說(shuō)明在發(fā)酵前期增加氮源有利于菌體生長(zhǎng)，但隨著菌體生長(zhǎng)的消耗，在后期不能維持適合乳酸菌產(chǎn)酸的還原性環(huán)境，使得乳酸產(chǎn)量和葡萄糖的轉(zhuǎn)化率下降。因此，認(rèn)為在30h ORP開(kāi)始回升的時(shí)候添加0.5%的玉米漿有利于乳酸合成。這也再次證明以O(shè)RP為反饋信號(hào)調(diào)控乳酸發(fā)酵過(guò)程的可行性和優(yōu)勢(shì)所在。

3 結(jié) 論

乳酸厭氧發(fā)酵體系中ORP與菌體生長(zhǎng)及乳酸產(chǎn)率間存在密切聯(lián)系，ORP值的變化能迅速地反映出乳酸菌的生理狀態(tài)和產(chǎn)酸能力的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以O(shè)RP為乳酸厭氧發(fā)酵的監(jiān)控參數(shù)，在30h ORP回升時(shí)添加0.5%的玉米漿，與不添加玉米漿的情況相比，乳酸產(chǎn)量提高了20%。但利用ORP調(diào)控乳酸發(fā)酵過(guò)程的其他參數(shù)還需要做進(jìn)一步的研究。

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Oxidoreduction Potential in Lactic Acid Fermentation Matrix as Regulated by Adding Corn Syrup

ZHANG Yong1,2，TIAN Yuan3，CONG Wei1,*
(1. Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China；2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China；3. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Due to the lack of effective monitoring parameters for anaerobic lactic acid fermentation process, it is difficult to observe the change in physiological status of lactic acid bacteria during the fermentation process. Oxidoreduction potential(ORP) can reflect the status change of anaerobic lactic acid fermentation system. In this study, the optimal addition concentration and time of corn syrup were explored through the evaluation of ORP change. Results indicated that the optimal addition concentration and time of corn syrup were 0.5% and 30 h, respectively. The addition of corn syrup could effectively regulate carbon-nitrogen ratio during the late stage of fermentation and maintain a beneficial reducing environment for lactic acid synthesis,which resulted in a 20% enhancement of lactic acid production. Therefore, ORP can be a monitoring parameter of lactic acid fermentation process, and corn syrup can modulate the ORP during fermentation process.

lactic acid；pH feedback feeding；oxidoreduction potential (ORP)；corn syrup

TQ921.3

A

1002-6630(2011)05-0202-05

2010-05-18

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z360)

張勇(1981—)，男，博士研究生，主要從事有機(jī)酸發(fā)酵研究。E-mail：zhy0033217@gmail.com

*通信作者：叢威(1969—)，男，研究員，博士，主要從事清潔生產(chǎn)、微生物發(fā)酵、生物冶金研究。E-mail：weicong@home.ipe.ac.cn