許 亮，師俊玲,*，任 健，王振平

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏大學 葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心，寧夏 銀川 750021)

枸杞果酒發(fā)酵過程中黃酮含量的變化

許 亮1，師俊玲1,*，任 健1，王振平2

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏大學 葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心，寧夏 銀川 750021)

以寧夏枸杞為原料，選用兩種酵母進行發(fā)酵，跟蹤檢測發(fā)酵過程中發(fā)酵醪中黃酮含量、pH值、酒精體積分數(shù)的變化。結果發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵過程中黃酮含量持續(xù)增加至最大值后基本保持不變，酒精體積分數(shù)不斷增大至最大值后基本保持不變，經(jīng)過回歸分析，兩者之間呈現(xiàn)良好的相關關系，并得到了其回歸模型；發(fā)酵醪的pH值在發(fā)酵前期表現(xiàn)為輕微下降，下降至一定值以后基本保持不變；不同的酵母菌種對發(fā)酵過程中各組分的變化趨勢無影響，但各組分的變化速度不同。

寧夏枸杞；果酒；發(fā)酵；黃酮

枸杞(Lycium barbarum)是中國傳統(tǒng)的、重要的藥食兩用同源植物[1-2]，其中以寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)最負盛名。枸杞除了具備豐富的維生素、礦物質(zhì)等普通營養(yǎng)成分以外，還含有大量的生物活性成分[3]，如具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化、降血糖等功能的黃酮類化合物[4-7]和具有降血脂、降血糖、抗脂肪肝、抗疲勞、抗衰老、清除自由基、抑制氧化脂質(zhì)生成等作用的枸杞多糖[8-11]。這些生物活性成分是枸杞及其保健制品的靈魂，也是評價枸杞質(zhì)量與品質(zhì)的重要指標。泡酒飲用是傳統(tǒng)的枸杞食用方式，但不適用于酒精過敏者，而且高度酒不利于人體健康。通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枸杞果酒，有望能夠較多地保留活性物質(zhì)，而且產(chǎn)品的風味較好、營養(yǎng)物質(zhì)全、酒精度較低，適用人群廣[12-13]。目前，有關枸杞果酒的研究主要針對于產(chǎn)品風味和感官指標的提高[14-15]，而有關發(fā)酵加工過程生物活性物質(zhì)的變化方面的研究尚未見報道?；诖耍狙芯恐攸c跟蹤考察發(fā)酵過程中枸杞果酒中黃酮含量的變化規(guī)律，分析其與發(fā)酵醪的pH值和酒精體積分數(shù)間的關系，以期為產(chǎn)品酒中生物活性物質(zhì)含量的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞購自寧夏中寧商寶有限公司。

酵母Excellence SP(以下簡稱SP)、酵母Harmonivin(以下簡稱Har) 法國Lamothe-Abiet公司；蘆丁(標準品) 中國藥品生物制品檢定所；苯酚 北京索萊寶科技有限公司；亞硫酸氫鈉(NaHSO3)、氫氧化鈉(NaOH)、亞硝酸鈉(NaNO2)、硝酸鋁(Al(NO3)3)等均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；電子恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；ZSD-1160培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；T-203電子天平 美國丹佛公司；pH-3C雷磁 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果酒的發(fā)酵工藝流程

干枸杞→料液比1:10(m/V)室溫浸泡30min→勻漿→調(diào)整成分(白砂糖、酒石酸、NaHSO3)→接種酵母→前發(fā)酵→分離倒罐→后發(fā)酵→澄清處理→過濾→除菌→成品

打漿：將浸泡后的枸杞用攪拌機(13000r/min)攪拌破碎30s成漿；調(diào)整成分：用白砂糖調(diào)整枸杞漿液的糖含量至20%，用酒石酸調(diào)整酸度至pH4，加入162.5mg/L NaHSO3抑制雜菌和防止氧化；發(fā)酵：按0.2g/L接種量分別接入酵母SP、Har，于20℃條件下靜置發(fā)酵4～8d，至發(fā)酵液中殘?zhí)呛坎辉僮兓癁榘l(fā)酵結束；檢測：發(fā)酵過程中每8h或12h取樣，4000r/min離心5min澄清處理后測定其中黃酮含量以及酒精體積分數(shù)的變化，同時記錄發(fā)酵過程中pH值的變化。

1.3.2 黃酮含量測定

參照文獻[16-17]所述方法，對黃酮含量進行測定。以蘆丁標準品為對照品，以質(zhì)量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線，可得回歸方程：ρ=6.0008A+0.0997，方程的R2=0.9995，式中A為吸光度，ρ為總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/100mL)。

測定樣品中總黃酮含量時，取5.0mL總黃酮樣品液，按照標準制作方法測吸光度，根據(jù)標準曲線所得回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

1.3.3 酒精體積分數(shù)的測定

參照文獻[18]，采用酒精計法測定枸杞果酒樣品的酒精體積分數(shù)。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH值的變化

在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的pH值整體呈現(xiàn)下降趨勢，下降至一定值后基本不變；接種Har酵母的發(fā)酵液pH值降低得較快，至第2天時已經(jīng)基本達最低值，而接種SP酵母的發(fā)酵液pH值從第1.5天開始才有較明顯下降，至3.5d時達最低值(圖1)。根據(jù)酵母發(fā)酵理論，發(fā)酵過程中酵母細胞通過EMP途徑降解葡萄糖，通過EMP途徑，葡萄糖最終被降解為丙酮酸，在無氧條件下，丙酮酸在酵母細胞中被還原成為乙醇，乙醇不會影響到發(fā)酵液的pH值；發(fā)酵過程中，葡萄糖的降解還會通過HMP途徑等其他方式進行，在這些途徑中會產(chǎn)生乳酸、檸檬酸等一些有機酸[19]，這會降低發(fā)酵液的pH值，因此發(fā)酵液的pH值會有所降低。

不同酵母菌種的代謝途徑和代謝能力都有會所差異。本研究中Har酵母的產(chǎn)酸能力稍強于SP酵母，這說明Har酵母的HMP代謝產(chǎn)酸的能力稍強。

圖1 枸杞果酒發(fā)酵過程中pH值的變化曲線Fig.1 pH change curve of Chinese wolfberry wine during fermentation process

2.2 發(fā)酵過程中的酒精體積分數(shù)變化

圖2 枸杞果酒發(fā)酵過程中酒精體積分數(shù)變化曲線Fig.2 Alcohol content change curve of Chinese wolfberry wine during fermentation process

隨著發(fā)酵過程的進行，酒醪的酒精體積分數(shù)不斷增大，至第6天(SP)和第7天(Har)酵母達到最大值，此后基本不變；相對而言，接種SP酵母的酒精體積分數(shù)增大幅度較大，但兩者的最終酒精體積分數(shù)基本相同(圖2)。這與發(fā)酵酒的最終酒精體積分數(shù)取決于發(fā)酵液含糖量的理論相符。含糖量一定時，酒的最終酒精體積分數(shù)相同。但是，不同的酵母菌種代謝產(chǎn)生酒精的能力和速度會有一定差異。在本研究中，SP酵母的乙醇代謝速度較快。

結合2.1節(jié)的結果可以發(fā)現(xiàn)，SP酵母的產(chǎn)酸能力稍弱，產(chǎn)乙醇能力稍強；Har酵母的產(chǎn)酸能力較強，產(chǎn)乙醇能力稍弱。這說明，兩種菌在葡萄糖的物質(zhì)代謝流方面的分配強度不同。進而說明，兩種菌內(nèi)部的酶系活性不同。另一原因可能是Har酵母的產(chǎn)酸能力強造成的低pH值抑制了酵母的生長和酒精代謝[20-21]。

2.3 發(fā)酵過程中黃酮含量的變化

圖3 枸杞果酒發(fā)酵過程中黃酮含量變化曲線Fig.3 Flavonoid content change curve of Chinese wolfberry wine during fermentation process

兩種酵母發(fā)酵枸杞果酒的過程中，黃酮含量的變化趨勢和幅度基本一致：在發(fā)酵初始階段黃酮含量增加較快，之后增加速度變慢，最后基本保持不變。隨著發(fā)酵過程的進行，酒液中的黃酮含量不斷增加(圖3)，與發(fā)酵過程中酒精含量的增加趨勢基本吻合。發(fā)酵過程中出現(xiàn)的黃酮含量變化趨勢是因為隨著發(fā)酵的進行，浸泡時間延長，黃酮的溶解量增加；同時，發(fā)酵液中酒精含量也在發(fā)酵過程中不斷增加，也有利于黃酮的提取[22]。由于黃酮在本研究條件下的穩(wěn)定性較高，當原料中黃酮全部溶入發(fā)酵液中以后，酒中黃酮含量也基本保持不變。

兩種酵母發(fā)酵所得酒中黃酮含量和變化趨勢差異不大，產(chǎn)酒精能力稍弱的Har酵母所得酒中黃酮含量反而稍高于產(chǎn)酒精能力強的SP酵母(圖3)。這可能是因為Har酵母的產(chǎn)酸能力較強，有利于提高黃酮的溶出率和穩(wěn)定性。

2.4 黃酮含量變化與酒醪酒精體積分數(shù)間的關系

黃酮以其具體分類(黃酮苷元、黃酮苷、二氫黃酮等)不同和分子排列不同，在水和乙醇等中的溶解性也不盡相同，根據(jù)枸杞中黃酮的提取研究可知，在較低的乙醇濃度范圍內(nèi)，黃酮的溶出率隨乙醇濃度的增加而升高[22]。從發(fā)酵過程中酒精體積分數(shù)和黃酮含量變化趨勢圖可以看出，發(fā)酵過程中酒醪中黃酮含量和酒精體積分數(shù)的變化趨勢基本相同，因此，推測兩者之間有一定的相關性。對兩者進行擬合和回歸分析發(fā)現(xiàn)，黃酮含量與酒精體積分數(shù)呈現(xiàn)良好的二次相關，回歸模型如下：

式中：X1、X2分別代表酵母SP、Har發(fā)酵的枸杞果酒的酒精體積分數(shù)/%；Y1、Y2分別代表酵母SP、Har發(fā)酵的枸杞果酒中黃酮含量/(g/L)。

對模型1、2進行方差分析發(fā)現(xiàn)(表1)，兩個模型在95%水平均達到顯著(P值分別為0.0018、0.0008)，同時模型R2均大于0.90(分別為0.9045、0.9001)，說明僅有不到10%的變異不能由模型解釋，兩模型都具有較高的參考價值。相對而言，模型1的R2稍大一些，說明其適用性相對更好一點。

表1 回歸模型的方差分析Table 1 Variance analysis of the developed regression model

綜合可知，果酒的發(fā)酵是一個復雜的過程。發(fā)酵過程中，酵母菌的種類、原料成分與特性(如含糖量、pH值)、發(fā)酵條件(如溫度、供氧量)等都會對發(fā)酵產(chǎn)生很大影響，從而引起發(fā)酵體系產(chǎn)生一定波動，進而影響發(fā)酵液中的酒精含量以及活性物質(zhì)在酒精的溶出率和穩(wěn)定性等。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同酵母(SP、Har)的自身生長、代謝特性決定了其在發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸和產(chǎn)酒精能力，并通過改變發(fā)酵液的環(huán)境(pH值)影響其自身酒精代謝的過程，同時由于枸杞黃酮在不同酒精體積分數(shù)和酸度條件下的溶解性與穩(wěn)定性不同，而影響了酒中最終的黃酮含量。發(fā)酵果酒中黃酮含量變化與酒精體積分數(shù)變化間呈現(xiàn)顯著的相關性。

3 結 論

本實驗考察了不同酵母發(fā)酵枸杞果酒過程中的pH值、酒精體積分數(shù)和黃酮含量的變化。結果表明，酵母Har能較好的在發(fā)酵后的枸杞果酒中保留黃酮含量；不同酵母對黃酮含量變化的影響基本相同。發(fā)酵過程中，酒醪中的黃酮含量和酒精體積分數(shù)變化之間呈現(xiàn)很好的二次相關性，可用回歸模型進行很好的描述。研究為提高枸杞果酒中黃酮含量提供了一定的參考，但在枸杞果酒發(fā)酵過程中黃酮的變化機制和具體原因方面尚需進行進一步研究。

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Change of Flavonoid Content in Chinese Wolfberry Wine during Fermentation

XU Liang1，SHI Jun-ling1,*，REN Jian1，WANG Zhen-ping2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；
2. Engineering Research Center of Grape and Wine, Ministry of Education, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

Chinese wolfberry fruits were fermented separately by two types of yeasts to produce fruit wines. Changes in flavonoid content, pH and alcohol content were measured during the fermentation period. Results indicated that both the contents of flavonoid and alcohol revealed a gradual increase and then remained at a stable level during the fermentation process.A quadratic regression model for flavonoid content as a function of alcohol content was developed, revealing a good correlation between both parameters based on regression analysis. pH decreased slightly at first and then was kept at a stable level during the fermentation period. Neither flavonoid content nor pH presented significant change. However, different change rates of the three parameters were observed.

Lycium barbarum L.；wine；fermentation；flavonoids

TS262.7

A

1002-6630(2011)05-0100-04

2010-09-20

國家自然科學基金項目(20862014)

許亮(1989—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：muzxl2007@gmail.com

*通信作者：師俊玲(1972—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：sjlshi2004@yahoo.com.cn