江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院(224001)卞偉鋼 胡平 宋曙 何嘯 王傳斌 陳萍
南通大學(226001)陳莉
NET-1(new EST tetraspan numbered 1)是由Serru等[1]于2000年在EST數(shù)據庫中發(fā)現(xiàn)的7個新的含四個跨膜區(qū)域蛋白超家族(TM4SF)的成員,是一個腫瘤增殖相關蛋白,在細胞信號轉導、調節(jié)、粘附、移動、增生和分化中起重要作用。已有報道,在多種惡性腫瘤中存在NET-1基因的異常表達[2~4]。表皮生長因子(EGFR)屬于表皮生長因子家族(erbB家族)成員之一[5],其異常表達參與了腫瘤細胞的增殖、腫瘤血管生成、粘附、侵襲、轉移等過程。NET-1與EGFR在肺癌的發(fā)生、惡性進展中是否發(fā)生了協(xié)同作用,在國內外的研究中尚未見報道。
1.1 病例與標本 收集2004年1月~2006年12月鹽城市第一人民醫(yī)院、鹽城市腫瘤醫(yī)院、鹽城市第三人民醫(yī)院手術切除的肺癌組織標本120例。全部病例均行常規(guī)病理檢查,明確診斷與臨床分期。120例標本中,男性84例,女性36例,男、女比例為1:0.43;年齡34~78歲,中位年齡60歲,小于60歲的有51例,大于60歲的有69例。全部病例術前均未接受過化療及放療。取10例肺癌周邊相對正常的肺組織作為對照組,所有組織均用10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,作HE及免疫組化染色。
1.2 主要試劑 兔抗人多克隆抗體NET-1由南通大學醫(yī)學院病理教研室惠贈,美國舊金山基因生物公司協(xié)助合成,鼠抗人單克隆抗體EGFR、SP免疫組化檢測試劑盒購自福州邁新生物技術公司。
1.3 免疫組織化學方法 常規(guī)脫蠟水化,組織抗原微波修復,10%山羊血清封閉。NET-1抗體的工作濃度為1:20,EGFR抗體的工作濃度為1:50,免疫組化染色SP法按說明書操作步驟進行,DAB-H2O2顯微鏡控制下顯色,蘇木精復染,常規(guī)脫水中性樹膠封片。使用PBS代替一抗處理的切片作為陰性對照,已知陽性組織切片作為陽性對照。
1.4 結果判斷 NET-1陽性染色定位于肺癌細胞的細胞質或細胞膜上,呈棕黃色顆粒,對陽性表達采用半定量積分法判斷,陽性細胞數(shù)<5%為0分,6%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分。染色強度呈淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。陽性細胞百分比和染色強度兩項積分相乘,0分為(-),1~4分為(+),5~8分為(++),9~12分為(+++)[6]。EGFR的陽性染色定位于腫瘤細胞的胞質或胞膜上、個別位于胞核上呈棕黃色顆粒。光鏡下選擇5個表達EGFR相對較多的區(qū)域,在高倍鏡視野下每個視野分別計數(shù)200個細胞,共計1000個細胞,按陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞的比例進行分級:陰性(-)為無棕黃色染色或染色陽性腫瘤細胞數(shù)<10%;弱陽性(+)為陽性細胞數(shù) 10%~<25%;中等陽性(++)為陽性細胞數(shù) 25%~<50%;強陽性(+++)為陽性細胞數(shù)≥50 %。
1.5 統(tǒng)計學處理 應用spss11.5英文版統(tǒng)計分析軟件對相關數(shù)據進行統(tǒng)計處理。率的比較采用x2檢驗和Fisher-exact檢驗,對影響生存預后的聯(lián)合效應采用 Cox比例風險模型進行多因素分析,納入的變量為性別、年齡、病變部位、臨床分期、病理分化程度、淋巴結轉移,采用Spearman等級相關分析兩指標間的關系。P<0.05有統(tǒng)計意義,所有檢驗和 P均為雙側。
2.1 對照組與肺癌組NET-1、EGFR表達情況的比較 NET-1陽性表達于肺癌細胞的細胞質或胞膜上,EGFR陽性表達于肺癌細胞的細胞質或核膜上(附圖1~4)。120例肺癌中,NET-1、EGFR陽性率分別為85.00%(102/120)、69.16%(83/120);對照組10例中陽性率分別為40.00%(4/10)、10.00%(1/10)。經統(tǒng)計學處理,肺癌組與對照組之間NET-1、EGFR的表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.0842,P=0.004;χ2=14.6362,P=0.002)。見附表1。
附表1 NET-1、EGFR在肺癌組與對照組中表達的比較
2.2 肺癌組織中NET-1、EGFR的表達與臨床病理因素的關系 肺癌組織中NET-1、EGFR的表達與腫瘤的臨床分期、分化程度及有無淋巴結轉移有關(P<0.05),而與患者性別、年齡、病變部位無顯著相關(P>0.05)。見附表2。
2.3 肺癌組織中NET-1、EGFR表達的關系筆者配對觀察了120例肺癌組織中NET-1、EGFR表達的情況,結果發(fā)現(xiàn)兩者同時為強陽性表達者20例,同時為陰性表達者11例,兩者的表達有相關性(χ2=51.8097,P=0.000),進一步做spearman等級相關分析,結果發(fā)現(xiàn)兩者在肺癌中的表達呈正相關(r=0.6107,P=0.000)。見附表3。
附表2 NET-1、EGFR的表達與肺癌臨床病理因素的關系
附表3 NET-1、EGFR在肺癌組織中表達的相互關系
四聚體超家族(TM4SF)是一組含有4個疏水性跨膜結構域的蛋白,在細胞外形成兩個大小不等的環(huán)狀結構,氨基端和羧基端位于胞漿內。長度較短。這些分子之間有很多高度保守的序列,并且大多數(shù)同源性序列都位于跨膜區(qū)域[7]。從1990年發(fā)現(xiàn)至今,TM4SF的成員已發(fā)展到了25個,NET-1基因是TM4SF家族成員之一,定位于1p34.1,其mRNA全長為1297bp,編碼序列為128-853bp,有241個氨基酸的開放閱讀框[1]。陳莉等[8]通過RT-PCR技術篩檢人類48種組織與相應腫瘤,發(fā)現(xiàn)除造血系統(tǒng)組織與相應腫瘤、心、腦、胰不表達外,幾乎所有的人類組織及相應腫瘤均表達NET-1基因。本研究結果顯示,NET-1基因在肺癌組織與正常肺組織中表達的差異有統(tǒng)計學意義,且在臨床分期晚、分化程度低、有淋巴結組的表達水平顯著升高,提示NET-1作為一種胞質蛋白可能可以傳導細胞分裂的信息和/或引起細胞異向分化或去分化,它的過度表達與細胞增殖有關,可明顯上調肺癌的惡性進展過程。
附圖1 低分化腺癌NET-1高表達陽性定位于癌細胞質(SP×400)
附圖2 低分化鱗癌NET-1高表達陽性定位于癌細胞質(SP×400)
附圖3 低分化腺癌EGFR高表達陽性定位于癌細胞質與核(SP×400)
附圖4 高分化鱗癌EGFR高表達陽性定位于癌細胞質(SP×400)
EGFR是一個由原癌基因c-erbB-1編碼的相對分子質量為 170000的跨膜糖蛋白,是一種細胞膜表面的糖蛋白受體,具有酪氨酸激酶活性,廣泛分布于除成熟骨骼肌細胞、體壁內胚層和造血組織以外的所有組織細胞。已有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中存在EGFR的高表達[9][10]。本研究發(fā)現(xiàn),肺癌組織中EGFR蛋白的表達較正常組織明顯升高,且在低分化、高分期有淋巴結轉移的病例中EGFR表達顯著高于高分化、低分期、無淋巴結轉移的病例,與文獻報道一致。由于酪氨酸激酶是細胞信號傳導的必要條件,因此,筆者認為在肺癌組織中EGFR與其配體結合后使得酪氨酸激酶磷酸化而激活酪氨酸激酶,通過催化與肌醇磷脂代謝有關的酶、激酶,調節(jié)蛋白磷酸化,促進產生第二信使,導致核內原癌基因c-myc、c-fos表達刺激肺癌細胞發(fā)生增殖,與肺癌的惡性進展密切相關。
盡管TM4SF蛋白的生物學功能不十分清楚,但有報道認為TM4SF與細胞粘附分子整合素的協(xié)同作用可特異性地調控后配體整合素依賴性信號轉導:影響粘附依賴性下游信號轉導事件,包括細胞蛋白的酪氨酸激酶的磷酸化和絲氨酸、蘇氨酸激酶PKB/c.Akt的激活,進而影響細胞的運動和分化。筆者對肺癌組織中NET-1與EGFR的表達進行了相關分析,結果提示兩者呈正相關,因此猜測在肺癌的發(fā)生、惡性進展中,EGFR作為一種酪氨酸激酶受體在其活化途徑中有受到TM4SF蛋白影響的可能性,兩者可協(xié)同調節(jié)肺癌細胞的惡性轉化與增殖。本研究結果顯示NET-1和EGFR在肺癌的發(fā)生、惡性進展中發(fā)揮了不可或缺的作用,且可能存在協(xié)同作用,因此二者聯(lián)合檢測可作為評估肺癌惡性程度指標。