孫 濤，陳春紅，朱 云，謝 晶

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

基于與葡萄糖美拉德反應(yīng)的低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性能

孫 濤，陳春紅，朱 云，謝 晶

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

以低聚殼聚糖作為氨基供體與提供羰基的葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)(氨基與羰基的物質(zhì)的量比分別為1:1、1:3和3:1)，醇沉法提取反應(yīng)4h的低聚殼聚糖衍生物 CG11-4、CG13-4、CG31-4以及8h的衍生物CG11-8、CG13-8和CG31-8。對(duì)6種衍生物進(jìn)行紅外表征和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，并研究其對(duì)超氧陰離子自由基(O2·)、羥自由基(·OH)和DPPH自由基的清除能力以及還原能力。結(jié)果顯示：低聚殼聚糖衍生物對(duì)O2·、·OH和DPPH自由基的清除能力以及還原能力均較低聚殼聚糖得到顯著提高，且羰氨物質(zhì)的量比相同時(shí)，8h衍生物的抗氧化性均優(yōu)于4h的衍生物，即隨著反應(yīng)的進(jìn)行低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性能增強(qiáng)。

低聚殼聚糖；美拉德反應(yīng)；反應(yīng)時(shí)間；抗氧化性

美拉德反應(yīng)主要是指食品中的氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白質(zhì))與羰基化合物(糖類)發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)。不同反應(yīng)階段會(huì)產(chǎn)生不同物質(zhì)，產(chǎn)物中除了最終階段生成的一些高分子化合物，如蛋白黑素外，還有一系列中間階段的產(chǎn)物——還原酮及含N、S的雜環(huán)化合物[1]。大量研究表明這類物質(zhì)具有一定的抗氧化、抗誘變、抗病毒等特性[2-3]。美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，與反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值、參與反應(yīng)的糖和氨基酸等有很大關(guān)系[4]。

低聚殼聚糖的抗氧化作用日益受到廣泛關(guān)注，化學(xué)改性可以改變低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性。低聚殼聚糖經(jīng)醚化[5]、季銨化等改性后[6-7]，其衍生物的抗氧化性降低；而經(jīng)硫酸酯化[8]以及一些接枝反應(yīng)[9]后，所得衍生物的抗氧化性有所提高。由于含有大量游離氨基，低聚殼聚糖可以作為氨基的供應(yīng)體與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)。本研究以美拉德反應(yīng)作為低聚殼聚糖改性的手段，不同物質(zhì)的量比的羰氨與葡萄糖反應(yīng)，制得不同反應(yīng)時(shí)間的低聚殼聚糖衍生物，考察衍生物對(duì)O2·、·OH、DPPH自由基的清除能力以及還原能力，為拓寬低聚殼聚糖的改性和開發(fā)天然高效的抗氧化劑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低聚殼聚糖(純度＞90%，脫乙酰度＞90%，凝膠色譜測(cè)定其分子質(zhì)量為8190D)，購(gòu)自浙江金殼生物化學(xué)有限公司；魯米諾、DPPH 美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司；抗氧化測(cè)試所需溶液由二次蒸餾水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

WFZ UV2000型紫外分光光度計(jì) 上海合利儀器有限公司；970CRT熒光分光光度計(jì) 南京昕航科學(xué)儀器有限公司；EQUINOX 55傅里葉紅外-拉曼光譜儀 德國(guó)布魯克公司；Waters 515型凝膠色譜儀 美國(guó)Waters公司；IFFM 2D型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀 西安瑞邁科技有限公司。

1.3 低聚殼聚糖衍生物的制備

稱取殼聚糖20.0g 3份，分別加入葡萄糖20.0、60.0g和6.7g，使得殼聚糖氨基和葡萄糖羰基的物質(zhì)的量比為1:1、1:3、3:1，用200mL的二次蒸餾水溶解，在80℃條件下回流反應(yīng)。反應(yīng)中通過吸光度變化來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)程[10]，確立8h為最終反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)4h和8h后，產(chǎn)物多次醇提，經(jīng)碘量法[11]測(cè)定無(wú)葡萄糖存在，烘干得殼聚糖衍生物CG11-4、CG13-4、CG31-4；CG11-8、CG13-8、CG31-8。

1.4 測(cè)試表征

紅外光譜在EQUINOX 55傅里葉紅外-拉曼光譜儀上進(jìn)行，采用KBr壓片法制樣，測(cè)定波數(shù)范圍為500～4000cm-1，分辨率為0.8cm-1。

產(chǎn)物的相對(duì)平均分子質(zhì)量及其分布采用GPC法測(cè)定。GPC測(cè)試條件如下：流動(dòng)相：0.2mol/L醋酸鈉和醋酸緩沖溶液，pH4.8；監(jiān)測(cè)器：Waters 2410示差折光監(jiān)測(cè)器；柱子：TOSOH BIOSEP TSK-Gel G4000SWXL(7.8mm×300mm)；溫度：40℃；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為：葡聚糖。

1.5 抗氧化性能測(cè)定

1.5.1 對(duì)O2·的清除作用

O2·清除能力的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定樣品溶液的峰面積。

式中：S0為空白溶液峰面積；Si為樣品溶液峰面積。

1.5.2 對(duì)·OH的清除作用

·OH的清除能力測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，依上述流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析方法測(cè)定并計(jì)算樣品清除·OH的活性，計(jì)算公式同1.5.1節(jié)。

1.5.3 對(duì)DPPH自由基的清除作用

取不同濃度的樣品溶液2.0mL，分別加入裝有2.0mL的濃度為1×10-4mol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液的比色管中，室溫下避光靜置30min，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液，得吸光度A0，無(wú)水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj[12]。

1.5.4 還原能力的測(cè)定

還原能力根據(jù)文獻(xiàn)[13]測(cè)定并稍做改進(jìn)。取2.0mL不同濃度的樣品，加入pH6.60的0.2mol/L磷酸緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液各2.5mL，混勻，50℃水浴20min后迅速冷卻，加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，混勻后3000r/min離心10min，取上清液2.0mL，加入2.5mL去離子水和0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10min后在700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚殼聚糖美拉德衍生物的測(cè)試表征

圖1 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物的紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of COS and its derivatives

圖1是低聚殼聚糖及其衍生物的紅外光譜圖。低聚殼聚糖及其衍生物在1100cm-1附近都有3個(gè)較強(qiáng)的多糖特征吸收峰，分別是1037、1085、1155cm-1，這些吸收峰都來(lái)自殼聚糖主鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可作為判定低聚殼聚糖及其衍生物存在的特征吸收峰[6]。低聚殼聚糖在1622、1516、1381cm-1附近的吸附帶，分別歸因于酰胺I(C＝O)、自由氨基(—NH2)和酰胺Ⅲ[14]。圖中顯示低聚殼聚糖美拉德衍生物在1516cm-1的峰較低聚殼聚糖有明顯降低，表明了自由氨基的減少，即低聚殼聚糖參與了美拉德反應(yīng)；同時(shí)，在1155、896cm-1處的吸收峰，分別歸因于C—O伸縮振動(dòng)和β-D-氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)后，該處吸收峰漸漸降低，表明殼聚糖的糖單元發(fā)生了變化[15]。

采用GPC法，測(cè)得樣品低聚殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為8190，低聚殼聚糖衍生物CG11-4、CG11-8、CG13-4、CG13-8、CG31-4和CG31-8的相對(duì)分子質(zhì)量分別為9850、12430、10540、11540、11860和11800。美拉德衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量較低的聚殼聚糖都有所增加，表明低聚殼聚糖分子中的游離氨基酸和還原糖基團(tuán)相互反應(yīng)形成了更大的分子。

2.2 低聚殼聚糖美拉德衍生物對(duì)O2·的清除

圖2 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物對(duì)O2·的清除能力Fig.2 Superoxide anion scavenging activities of COS, CG11-4, CG11-8,CG13-4, CG13-8, CG31-4 and CG31-8

圖2描述了低聚殼聚糖及其3種羰氨不同物質(zhì)的量比反應(yīng)衍生物對(duì)·的清除效果。在1:1體系中，CG11-4和CG11-8的IC50(對(duì)自由基清除率為50%時(shí)所需要的自由基清除劑濃度)分別為0.090、0.066mmol/L，而低聚殼聚糖的IC50為0.198mmol/L，可見兩種衍生物對(duì)的清除能力均優(yōu)于低聚殼聚糖，且反應(yīng)8h的衍生物抗氧化活性明顯優(yōu)于4h的衍生物；此外，CG13-4和CG13-8的IC50分別為0.097、0.077mmol/L；CG31-4和CG31-8的IC50分別為0.091、0.078mmol/L，可見對(duì)的清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)镃G13-8＞CG13-4＞COS；CG31-8＞CG31-4＞COS。研究表明，低聚殼聚糖對(duì)的清除活性可能與其分子中的活性羥基和氨基有關(guān)[16]，低聚殼聚糖作為氨基的供體與提供羰基的葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)其活性氨基含量下降，但其衍生物對(duì)的清除能力有所提升，且3種比例下反應(yīng)8h的衍生物抗氧化活性均優(yōu)于反應(yīng)4h的衍生物。

2.3 低聚殼聚糖美拉德衍生物對(duì)·OH的清除

圖3 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物對(duì)·OH的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activities of COS, CG11-4, CG11-8,CG13-4, CG13-8, CG31-4 and CG31-8

·O H清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)。·OH在其氧原子上含有一個(gè)未配對(duì)電子，奪取電子的能力很強(qiáng)，是體內(nèi)最活潑的活性氧，可導(dǎo)致許多病理變化[17]。3種羰氨不同物質(zhì)的量比低聚殼聚糖及其美拉德衍生物對(duì)·O H的清除活性如圖3所示，對(duì)·OH的清除能力強(qiáng)弱次序?yàn)镃G11-8＞CG11-4＞COS；CG13-8＞CG13-4＞COS；CG31-8＞CG31-4＞COS。即美拉德反應(yīng)的低聚殼聚糖衍生物對(duì)·OH的清除活性較低聚殼聚糖均得到提升，且與葡萄糖反應(yīng)8h的衍生物對(duì)·OH的清除能力更強(qiáng)，此現(xiàn)象與對(duì)O2·的清除效果相一致。

2.4 低聚殼聚糖美拉德衍生物對(duì)DPPH自由基的清除

圖4 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activities of COS, CG11-4, CG11-8,CG13-4, CG13-8, CG31-4 and CG31-8

圖4描述3種羰氨不同物質(zhì)的量比殼聚糖及其衍生物對(duì)DPPH自由基的清除能力。CG11-4和CG11-8的IC50分別為0.047、0.022mmol/L，CG13-4、CG13-8的IC50分別為0.032、0.026mmol/L，CG31-4和CG31-8的IC50分別為0.029、0.025mmol/L，而COS的IC50為0.142mmol/L。即對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)弱次序?yàn)镃G11-8＞CG11-4＞COS；CG13-8＞CG13-4＞COS；CG31-8＞CG31-4＞COS。這一結(jié)果同樣與對(duì)O2·和·OH的清除結(jié)果相似。

2.5 低聚殼聚糖美拉德衍生物的還原能力

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，通過提供電子，阻斷了Fe2+向Fe3+的轉(zhuǎn)變，從而表現(xiàn)出一定的還原能力。研究表明，抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關(guān)系[18]。如圖5所示，在濃度為0.20mmol/L時(shí)，CG11-4和CG11-8的吸光度分別為0.850和1.377，CG13-4和CG13-8的吸光度分別為1.111和1.274，CG31-4和CG31-8的吸光度分別為0.771和0.868，而COS的吸光度為0.330。即還原能力強(qiáng)弱順序?yàn)镃G11-8＞CG11-4＞COS；CG13-8＞CG13-4＞COS；CG31-8＞CG31-4＞COS，這與前面的結(jié)果保持一致。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以美拉德反應(yīng)為低聚殼聚糖的改性手段，在3種羰氨不同物質(zhì)的量比與葡萄糖反應(yīng)來(lái)制備低聚殼聚糖衍生物，并檢測(cè)了低聚殼聚糖及其衍生物對(duì)O2·、·OH和DPPH自由基的清除能力以及還原能力。殼聚糖的抗氧化活性與其相對(duì)分子質(zhì)量的大小密切相關(guān)[19]，低相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖抗氧化性優(yōu)于高相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖，本研究中的原料低聚殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為8190，具有一定的抗氧化活性。結(jié)果顯示，美拉德反應(yīng)后衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量較低聚殼聚糖都有所增加，但其抗氧化性均優(yōu)于低聚殼聚糖，故可以認(rèn)為美拉德反應(yīng)是低聚殼聚糖改性的有效手段；3種羰氨不同物質(zhì)的量比的低聚殼聚糖與葡萄糖美拉德反應(yīng)的8h所得的衍生物抗氧化性均優(yōu)于4h，說明在美拉德反應(yīng)過程中，反應(yīng)時(shí)間相對(duì)越長(zhǎng)抗氧化性越佳，這可能與類黑素等褐變物質(zhì)的積累有關(guān)，相關(guān)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。本研究為制備天然、安全、高效的抗氧化劑提供了很好的思路。

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Antioxidant Activity Assessment of Chitosan Oligosaccharide Derivatives from Maillard Reaction with Glucose

SUN Tao，CHEN Chun-hong，ZHU Yun，XIE Jing
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Maillard reaction was initiated by heating chitosan oligosaccharide (COS) with glucose at ratios of 1:1, 1:3 and 3:1 of amine group to carbonyl group, respectively. Chitosan oligosaccharide derivatives after 4 hours named CG11-4, CG13-4 and CG31-4 were extracted by alcohol precipitation, and CG13-8, CG31-8 and CG11-8 were obtained after 8 hours. All of the derivatives were characterized by fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and their molecular weight was determined by gel permeation chromatograph (GPC). Their antioxidant properties in vitro were investigated, including superoxide, hydroxyl and 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals scavenging capabilities as well as reducing power. The results showed that all of the chitosan oligosaccharide derivatives had strong antioxidant activity when compared with chitosan oligosaccharide. The antioxidant activity was found to be in the order of CG11-8 ＞ CG11-4, CG13-8 ＞ CG13-4, CG31-8 ＞ CG31-4, indicating that the derivatives had the better antioxidant activity as the reaction processed.

chitosan oligosaccharide；Maillard reaction；reaction time；antioxidant activity

TS202.3

A

1002-6630(2011)03-0014-05

2010-05-26

上海市生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)科技領(lǐng)域重點(diǎn)科技項(xiàng)目(08391911500)；2009年上海市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人計(jì)劃項(xiàng)目(09XD1402000)；上海市教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)

孫濤 (1970—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槎嗵堑母男约吧锕δ艿拈_發(fā)。E-mail：taosun@shou.edu.cn