北京市延慶縣疾病預(yù)防控制中心（102100）崔玉娟 任淑敏 蘇東霞

2010年11月2日，北京市延慶縣某小學(xué)出現(xiàn)了15例不明原因發(fā)熱癥狀兒童病患，主要臨床癥狀為發(fā)熱（體溫37.5℃以上）、咳嗽等。為查明疫情原因、制定有效的防治措施，及時(shí)控制、撲滅疫情并提供可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，本縣疾病預(yù)防控制中心應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)患者的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、甲型H1N1流感病毒等亞型檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 用帶有無(wú)菌聚丙烯纖維頭及聚丙烯桿的拭子采集發(fā)病3天內(nèi)的病例咽拭子12份，于4℃保存下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 主要試劑與儀器 QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit、AgPath-IDTm onestep RT-PCR Kit（美國(guó)ABI公司）、引物（fluA、fluB、H1、H3、swfluA、swH1、RNP由北京市CDC 提供）、QIAGENQIAvac 24 Plus（德國(guó)QIAGEN公司）、離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）、生物安全柜（上海東聯(lián)）、AB 7500 fast PCR System（美國(guó)ABI公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本預(yù)處理 將12份咽拭子在渦旋振蕩器上充分震蕩混勻，室溫靜置10min。

1.3.2 核酸提取 分別取200μl預(yù)處理好的標(biāo)本依照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸提取，最后分別得到60μl樣本核酸作為擴(kuò)增模板。

1.3.3 核酸擴(kuò)增 按照ABI公司的AgPath-IDTm one-step RTPCR Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)12份核酸樣本進(jìn)行real-time RT-PCR擴(kuò)增。選擇FAM熒光檢測(cè)模式。

1.3.4 結(jié)果判斷 陰性對(duì)照：無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)，無(wú)CT值或0。陽(yáng)性對(duì)照：有擴(kuò)增曲線(xiàn)，CT值＜30。檢測(cè)樣本：樣本有典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)且CT值≤37，報(bào)告樣本陽(yáng)性。見(jiàn)附表1。

2 結(jié)果

12份病例樣本完成PCR擴(kuò)增后，其擴(kuò)增曲線(xiàn)顯示：8份樣本為fluA、RNP及H3同時(shí)陽(yáng)性，1份樣本七種引物探針核酸擴(kuò)增均陰性，3份樣本僅RNP引物探針核酸擴(kuò)增陽(yáng)性。見(jiàn)附表2、附圖。

3 討論

Real-time RT-PCR是將熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET） 應(yīng)用于常規(guī)PCR儀中，通過(guò)受體發(fā)色團(tuán)之間偶極與偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號(hào)強(qiáng)度與DNA或RNA產(chǎn)量成正比，檢測(cè)PCR過(guò)程的熒光訊號(hào)便可得知靶序列初始濃度，從而達(dá)到定量目的[1][2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1995年由美國(guó)PE公司推出后，Heid[3]等首先就其原理方法進(jìn)行了報(bào)道。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、PCR污染少、快速簡(jiǎn)潔、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[4]，可在3～4h內(nèi)得到擴(kuò)增結(jié)果。目前已在動(dòng)植物基因工程、微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[5]，已經(jīng)成為基層實(shí)驗(yàn)室快速檢驗(yàn)的重要手段。

附表1 結(jié)果判斷原則

附表2 12份病例樣本PCR擴(kuò)增結(jié)果

附圖 12份樣本的real time RT-RCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

在流感樣的實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)中，本研究利用fluA、fluB、H1、H3、swfluA、swH1等6種引物探針來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)流感的分型分析。研究中還引入RNP引物探針作為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)人細(xì)胞中的RnaseP基因，從而判斷樣本采集及核酸提取是否合格。只有在采集的樣本合格的前提下，才能進(jìn)一步分析得知。12份病例樣本的核酸擴(kuò)增結(jié)果顯示，1號(hào)樣本RNP擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說(shuō)明這份樣本并未采集到患者的咽部上皮細(xì)胞，為無(wú)意標(biāo)本。因此，不能說(shuō)明1號(hào)病例是否為流感病例。

同一起聚集性疫情中，病例的臨床癥狀相似，理論上其樣本的實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該一致，但實(shí)際上有時(shí)會(huì)有差異。跟樣本采集的質(zhì)量有關(guān)，若沒(méi)有采集到病例的咽部上皮細(xì)胞，則會(huì)得到陰性檢測(cè)結(jié)果；跟采樣的時(shí)間也有密切的關(guān)系，應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，一般采集發(fā)病3日內(nèi)的標(biāo)本。此外，由于RNA不穩(wěn)定，極易降解，采集到的標(biāo)本應(yīng)在4℃下立即送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，如不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)在-20℃或-80℃下冷凍保存。臨床標(biāo)本運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中應(yīng)避免反復(fù)凍融，若標(biāo)本運(yùn)輸保存不當(dāng)，則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。擴(kuò)增試劑的靈敏度也是影響檢測(cè)結(jié)果的一個(gè)重要因素，不同的檢測(cè)試劑盒其引物探針的靈敏度不同，最后所得到的檢測(cè)結(jié)果也會(huì)有一定差別。