汪 琳 趙胤澤 羅 英 周 琦 賴平安 張向東 柏亞鐸

(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026)

轉(zhuǎn)Bt基因作物恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測技術(shù)

汪 琳 趙胤澤 羅 英 周 琦 賴平安 張向東 柏亞鐸

(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026)

[目的]建立一種快速檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的方法。[方法]利用Bt的Cry1ab/ac基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,建立LAMP檢測方法以及優(yōu)化反應(yīng)體系,并進(jìn)行LAMP的特異性和靈敏度試驗(yàn)。[結(jié)果]成功建立轉(zhuǎn)Bt基因作物的LAMP檢測方法,得到最優(yōu)的反應(yīng)體系。在特異性試驗(yàn)中,轉(zhuǎn)Bt基因作物基因組DNA均呈陽性,而非轉(zhuǎn)基因作物、轉(zhuǎn)Bar基因作物、轉(zhuǎn)CPTI基因作物、轉(zhuǎn)EPSPS基因作物等均為陰性;在靈敏度試驗(yàn)中,轉(zhuǎn)Bt基因作物的最低檢測限為10個拷貝。[結(jié)論]LAMP方法具有很高的特異性和靈敏度,可用于轉(zhuǎn)Bt基因作物的現(xiàn)場快速檢測。

轉(zhuǎn)Bt基因作物;環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

1 前言

隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大量進(jìn)入市場,其生物安全性以及可能對人類健康和生態(tài)環(huán)境的影響引起了全世界越來越多的關(guān)注。因此,建立有效的轉(zhuǎn)基因檢測方法,快速鑒定轉(zhuǎn)基因食品、植物、種子等,對于檢驗(yàn)檢疫、食品安全監(jiān)管、農(nóng)業(yè)執(zhí)法部門和科研監(jiān)測等具有重要的意義。轉(zhuǎn)基因成分的檢測有很多種方法,目前常用的有化學(xué)組織檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法、外源基因整合鑒定法、Western雜交法、試紙條、生物測定檢測法、基因芯片法、競爭性PCR、實(shí)時定量PCR和PCR-EL ISA等[1-3]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是Notomi等在2000年開發(fā)的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法[4-5],這種方法不需要模板的熱變性[6],擴(kuò)增效率高,幾十分鐘擴(kuò)增產(chǎn)物可達(dá)109-1010個拷貝;有無肉眼可見的焦磷酸鎂白色沉淀可簡單判斷核酸是否擴(kuò)增[7-8]。增加環(huán)引物的LAMP法,可使反應(yīng)速度提高1/2-1/3[9]。目前LAMP法已廣泛應(yīng)用于包括DNA病毒、RNA病毒[10]、細(xì)菌[11]和寄生蟲[12]等傳染性疾病的定性和定量檢測,但在轉(zhuǎn)Bt基因作物檢測中還沒有報道。在本研究中,我們根據(jù)Cry1ab/ac基因設(shè)計(jì)LAMP引物,并用核酸試紙條對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,建立能對轉(zhuǎn)Bt基因植物、種子作出有效、準(zhǔn)確、快速鑒定的檢測方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品

轉(zhuǎn)基因大米BT63、轉(zhuǎn)基因玉米品系Bt11、Mon810、NK603均由吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局提供;轉(zhuǎn)基因玉米品系M IR604、Bt11-sp0401由本局保存、提供。

2.1.2 主要試劑

甜菜堿(Betain):購自Sigma公司;dNTP:購自Promega公司;Bst大片段DNA聚合酶:購自New England Biolabs公司;基因組小量抽提試劑盒:購自上海生工生物工程有限公司;Milenia GenLine Hybri Detect試劑盒:為德國進(jìn)口原裝核酸試紙條。

2.1.3 主要儀器

高速冷凍離心機(jī):5417R,Eppendorf,德國;恒溫金屬浴:TB02-1,HOR IBAO,日本;微量移液器:0.1-1000μL,Eppendorf,德國。

2.2 方法

2.2.1 樣品DNA提取

用基因組小量抽提試劑盒提取轉(zhuǎn)基因作物基因組DNA,按照制造商的說明所提取的DNA,溶于

50μL的TE中,儲存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成

針對Genbank中Bt的Cry1ab/ac基因(Accession number EU816953),采用LAMP專用引物設(shè)計(jì)軟件,結(jié)合Primer Premier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的6條引物是:2條外引物(F3和B3),2條內(nèi)引物(FIP和BIP),2條環(huán)引物(LF和LB,分別標(biāo)記生物素和熒光素)。擴(kuò)增Cry1ab/ac基因的位置從283至583區(qū)域301 bp目的基因片段,引物的名稱和具體序列見表1。FIP由F1的一個互補(bǔ)序列和正向序列F2構(gòu)成,BIP由B1的一個互補(bǔ)序列和正向序列B2構(gòu)成,每條引物在基因組中的具體位置如圖1所示。

表1 擴(kuò)增Cry1ab/ac基因的LAMP引物序列

圖1 用來設(shè)計(jì)LAMP引物的Cry1ab/ac基因的核酸序列

引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,純度為HPLC級別。引物用滅菌雙蒸水溶解,配制成20μmol/L母液。

2.2.3 LAMP反應(yīng)體系的建立

根據(jù)已有文獻(xiàn),初步確定反應(yīng)體系為20μL,其中包括FIP、BIP各1.6μmol/L,F3、B3各0.2μmol/L,LF、LB各0.8μmol/L,dNTPs為1mmol/L,Betaine為0.5mol/L,10×Thermo Pol Reaction buffer為2μL,MgSO4為0.6μL,8U的Bst DNA聚合酶大片段,模板DNA為2μL,用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20μL(下稱基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系)。60℃孵育30min。然后以102拷貝/μL的Bt重組質(zhì)粒為模板,依次對體系中的MgSO4濃度、引物濃度比、dNTPs濃度、Betaine濃度及反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.4 LAMP反應(yīng)中MgSO4濃度的優(yōu)化

在2.2.3的基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系中(無Mg-SO4),分別加入終濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L的MgSO4,混勻后放置60℃孵育30min。

2.2.5 LAMP反應(yīng)中引物濃度比的優(yōu)化

2.2.5.1 內(nèi)引物與外引物濃度比的優(yōu)化

在2.2.3的基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系中(無FIP、BIP),按照2:1、4:1、6:1、8:1、10:1的比例,依次加入對應(yīng)濃度的FIP、BIP,混勻后放置60℃孵育30min。

2.2.5.2 環(huán)引物與外引物濃度比的優(yōu)化

在2.2.3的基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系中(無LF、LB),按照1:1、2:1、4:1、6:1、8:1的比例,依次加入對應(yīng)濃度的LF、LB,混勻后放置60℃孵育30min。

2.2.6 LAMP反應(yīng)中dNTPs濃度的優(yōu)化

在2.2.3的基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系中(無dNTPs),分別加入終濃度為0.5、0.75、1.0、1.25、1.5mmol/L的dNTPs,混勻后放置60℃孵育30min。

2.2.7 LAMP反應(yīng)中Betaine濃度的優(yōu)化

在2.2.3的基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系中(無Betaine),分別加入終濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0mol/L的Betaine,混勻后放置60℃孵育30min。

2.2.8 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化

將2.2.3的基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系分別在60℃、62℃、64℃3個溫度下孵育30min。

2.2.9 LAMP反應(yīng)結(jié)果觀察

反應(yīng)結(jié)束后,取5-10μL LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物,用Milenia GenLine HybriDetect試劑盒檢測。取100μL檢測緩沖液于微孔板中,再用微量移液器吸取5-10μL LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物,加在試劑盒提供的試紙條上,5-15min內(nèi)目測結(jié)果,觀察試紙條是否出現(xiàn)紫色線條。

2.2.10 LAMP的特異性試驗(yàn)

抽提非轉(zhuǎn)基因作物、轉(zhuǎn)CPTI基因作物、轉(zhuǎn)EPSPS基因作物、轉(zhuǎn)Bar基因作物的基因組DNA,用最佳反應(yīng)體系分別擴(kuò)增,試紙條觀察結(jié)果。

2.2.11 LAMP的敏感性試驗(yàn)

將含Bt目的基因片段的重組質(zhì)粒DNA作10n倍比稀釋,取100、101、102、103拷貝/mL 4個稀釋度,用最佳反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增,試紙條觀察其結(jié)果。

2.2.12 LAMP檢測穩(wěn)定性和可靠性試驗(yàn)

采用熒光定量PCR檢測結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)Bt基因玉米品系Mon810為試驗(yàn)樣品對其外源基因Cry1ab/ac進(jìn)行連續(xù)10次重復(fù)擴(kuò)增,確定LAMP檢測的穩(wěn)定性。試驗(yàn)過程中設(shè)立陰性和空白對照。對不同類型的轉(zhuǎn)Bt基因作物如大豆、玉米、棉花的基因組進(jìn)行LAMP反應(yīng),確定LAMP檢測的可靠性。

3 結(jié)果與分析

3.1 LAMP反應(yīng)中MgSO4濃度的優(yōu)化結(jié)果

使反應(yīng)體系中MgSO4的終濃度依次為1.0-5.0mmol/L,在這幾個濃度梯度下分別進(jìn)行LAMP反應(yīng),產(chǎn)物用試紙條進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖2所示。

圖2 LAMP反應(yīng)中MgSO4濃度的優(yōu)化

圖2顯示,當(dāng)反應(yīng)體系中MgSO4的終濃度為1.0mmol/L和5.0mmol/L的時候,試紙條上沒有出現(xiàn)紫色的檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中MgSO4的終濃度為2.0mmol/L和3.0mmol/L的時候,試紙條上出現(xiàn)明顯的紫色檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中MgSO4的終濃度達(dá)到4.0mmol/L的時候,檢測線強(qiáng)度明顯減弱。比較檢測線的強(qiáng)度,最終確定20μL的反應(yīng)體系中MgSO4的終濃度為3.0mmol/L。

3.2 LAMP反應(yīng)中引物濃度比的優(yōu)化結(jié)果

3.2.1 內(nèi)引物與外引物濃度比的優(yōu)化結(jié)果

使反應(yīng)體系中內(nèi)引物與外引物濃度比依次為2:1-10:1,在這幾個濃度比下分別進(jìn)行LAMP反應(yīng),產(chǎn)物用試紙條進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖3所示。

圖3 LAMP反應(yīng)中內(nèi)引物與外引物濃度比的優(yōu)化

圖3顯示,當(dāng)反應(yīng)體系中的內(nèi)引物與外引物濃度比為2:1時,試紙條上未出現(xiàn)紫色的檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中的內(nèi)引物與外引物濃度比為4:1時,試紙條上出現(xiàn)淡淡的檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中的內(nèi)引物與外引物濃度比為6:1時,試紙條上出現(xiàn)明顯的紫色檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中的內(nèi)引物與外引物濃度比達(dá)到8:1、10:1時,檢測線強(qiáng)度明顯減弱。因此最終確定20μL的反應(yīng)體系中內(nèi)引物與外引物的濃度比為6:1。

3.2.2 環(huán)引物與外引物濃度比的優(yōu)化結(jié)果

使反應(yīng)體系中環(huán)引物與外引物濃度比依次為1:1-8:1,在這幾個濃度比下分別進(jìn)行LAMP反應(yīng),產(chǎn)物用試紙條進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖4所示。

圖4 LAMP反應(yīng)中環(huán)引物與外引物濃度比的優(yōu)化

圖4顯示,當(dāng)反應(yīng)體系中的環(huán)引物與外引物濃度比為1:1時,試紙條上未出現(xiàn)紫色的檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中的環(huán)引物與外引物濃度比為2:1時,試紙條上出現(xiàn)淡淡的檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中的環(huán)引物與外引物濃度比為4:1時,試紙條上出現(xiàn)明顯的紫色檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中的環(huán)引物與外引物濃度比達(dá)到6:1、8:1時,檢測線強(qiáng)度明顯減弱。因此最終確定20μL的反應(yīng)體系中環(huán)引物與外引物的濃度比為4:1。

3.3 LAMP反應(yīng)中dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果

使反應(yīng)體系中dNTPs的終濃度依次為0.5-1.5mmol/L,在這幾個濃度梯度下分別進(jìn)行LAMP反應(yīng),產(chǎn)物用試紙條進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖5所示。

圖5 LAMP反應(yīng)中dNTPs濃度的優(yōu)化

圖5顯示,當(dāng)反應(yīng)體系中的dNTPs終濃度為0.5mmol/L時,試紙條上未出現(xiàn)紫色的檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中的dNTPs終濃度為0.75mmol/L時,試紙條上出現(xiàn)明顯的紫色檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中的dNTPs終濃度達(dá)到1.0mmol/L,甚至更高的時侯,試紙條上的檢測線強(qiáng)度明顯減弱,直至消失。所以最終確定20μL的反應(yīng)體系中的dNTPs終濃度為0.75mmol/L。

3.4 LAMP反應(yīng)中Betaine濃度的優(yōu)化結(jié)果

使反應(yīng)體系中Betaine的終濃度依次為0-1.0mol/L,在這幾個濃度梯度下分別進(jìn)行LAMP反應(yīng),產(chǎn)物用試紙條進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖6所示。

圖6 LAMP反應(yīng)中Betaine濃度的優(yōu)化

圖6顯示,當(dāng)反應(yīng)體系中的Betaine終濃度為0時,試紙條上出現(xiàn)明顯的紫色檢測線;當(dāng)反應(yīng)體系中的Betaine終濃度逐漸增加時,試紙條上檢測線出現(xiàn)明顯減弱趨勢,直至完全消失。所以最終確定20μL的反應(yīng)體系中的Betaine終濃度為0。

3.5 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果

分別采取60、62、64℃3個不同的溫度進(jìn)行LAMP反應(yīng),擴(kuò)增產(chǎn)物用試紙條進(jìn)行檢測,結(jié)果見圖7所示。

圖7 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化

圖7顯示,在60、62、64℃3個不同溫度下進(jìn)行LAMP反應(yīng),其中在62℃下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,試紙條上的檢測線強(qiáng)度最強(qiáng),60、64℃反應(yīng)時的檢測線強(qiáng)度較弱。所以本研究選擇62℃作為LAMP的最適反應(yīng)溫度。

3.6 LAMP的特異性試驗(yàn)結(jié)果

將提取的不同類型的轉(zhuǎn)Bt基因作物及非轉(zhuǎn)Bt基因作物的基因組DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng),擴(kuò)增產(chǎn)物用試紙條進(jìn)行檢測,結(jié)果試紙條上均未見明顯的檢測線。

3.7 LAMP的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將預(yù)先稀釋好的不同濃度的Bt重組質(zhì)粒進(jìn)行LAMP反應(yīng),試紙條檢測結(jié)果顯示LAMP檢測的最低檢測限為10個拷貝,見圖8。

圖8 LAMP擴(kuò)增靈敏度試紙條結(jié)果

3.8 LAMP的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

對轉(zhuǎn)Bt基因玉米品系Mon810進(jìn)行10次重復(fù)LAMP反應(yīng),試紙條檢測結(jié)果均呈現(xiàn)陽性信號,且試紙條檢測線強(qiáng)度一致,表明LAMP檢測具有很好的穩(wěn)定性。

4 討論

與傳統(tǒng)的PCR檢測相比,LAMP檢測在恒溫條件下進(jìn)行,操作簡便,快速省時,特異性較強(qiáng),不需要使用昂貴、精密的儀器設(shè)備,而且可以用試紙條直接對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷,檢測成本低,適宜在一些基層機(jī)構(gòu)開展檢測工作。然而LAMP法對反應(yīng)條件有嚴(yán)格的要求,如果條件不當(dāng),本該出現(xiàn)的結(jié)果則不能顯現(xiàn)。

本試驗(yàn)針對轉(zhuǎn)Bt基因作物外源基因Cry1ab/ac的序列設(shè)計(jì)了一套LAMP反應(yīng)引物,通過對LAMP法中的一些擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,使擴(kuò)增達(dá)到最佳效果。結(jié)果證實(shí)該方法的可靠性、特異性及穩(wěn)定性良好,靈敏度可達(dá)到10拷貝/mL。

5 結(jié)語

LAMP技術(shù)為快速檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物提供了新的發(fā)展方向,有望成為簡易的常規(guī)檢測手段,尤其適用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)。使用LAMP技術(shù)快速檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物能為商檢、海關(guān)、食品安全監(jiān)管及農(nóng)業(yè)執(zhí)法部門等提供有益的借鑒。

[1] HardeggerM,Brodmann P,HemnannA.Quantitative detection of the 35S promoter and the NOS terminator using quantitative competitive PCR[J].Eur Food Res Technol,1999,209(2):83-87.

[2] Marra Hermandez,Teresa Esteve,Salome Prat,et al.Development of real-time PCR systems based on SYBR Green I,Amplifluor and TaqMan technologies for specific quantitative detection of the transgenic maize event GA21[J].Journal of Cereal Science,2004,39(1):99-107.

[3] Liua GB,Sua C W,Xua Q W,et al.Liquid-phase hybridization based PCR-EL ISA for detection of genetically modified organisms in food[J].Food Control,2004,15(4):303-306.

[4] Notomi T,Okayama H,MasubuchiH,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research,2000,28(12):e63i-e63vii.

[5] Eiken Chemical Co.Ltd.The principles of LAMP method.http://loopamp.eiken.co.ip/e/tech/index.html.2003.

[6] Nagamine K,Watanabe K,Ohtsuka K,et al.Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template[J].Clinical Chemistry,2001,47(9):1742-1743.

[7] Yasuyoshi Mori,Tsuyoshi Hirano,Tsugunori Notomi.Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers[J].BMC Biotechnology,2006,6:31.

[8] Mori Y,Nagamine K,Tomita,et al.Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2001,289(1):150-154.

[9] Nagamine K,T Hase,T Notomi.Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers[J].Molecular and Cellular Probes,2002,16(3):223-229.

[10] Munraym G,Thompsonwf.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acid Res,1980,8:4321-4325.

[11] Shivappa R B,Savan R,Kono T,et al.Detection of spring viraemia of carp virus(SVCV)by loop-mediated isothermal amplification(LAMP)in koicarp,Cyprinus carpio L.[J].J Fish Dis,2008,31(4):249-258.

[12] Pandeyb D,Poudel A,Yoda T,et al.Development of an in 2 house loop-mediated isothermal amplification(LAMP)assay for detection of Mycobacterium tuberculosis and evaluation in sputum samples of Nepalese patients[J].J Med Microbiol,2008,57:439-443.

Rapid Detection of Transgenic Bt Crops by Isothermal Nucleic Amplification

Wang Lin,Zhao Yinze,Luo Ying,Zhou Qi,Lai Ping’an,Zhang Xiangdong,Bai Yaduo

(Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing,100026)

s:[Objectives]To establish a specific,sensitive and rapid method for detecting transgenic Bt crops.[Methods]Cry1ab/ac gene was used for the design of primers,the reaction conditions were optimized and then LAMP method was established.Specificity and sensitivity evaluations also included in the experiment.[Results]LAMP method was established successfully,it was proved to be a high specific method which could detect all transgenic Bt crops,while results of detection of non-transgenic crops,transgenic Bar crops,transgenic CPTI crops,transgenic EPSPS crops,etc.were all negative.The detection limit of LAMP was 10copies/tube for transgenic Bt crops.[Conclusions]The established LAMP was a specific and sensitive method for detecting transgenic Bt crops and it can be used for Rapid detection of transgenic Bt crops.

Transgenic Bt Crops;Loop-Mediated Isothermal Amplification;LAMP

Q789

國家“十一五”轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)課題(2008ZX08012-005)