蔡 穎 周廣彪 陳文婉 許如蘇

(汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515031)

7種甲型H1N1流感病毒核酸檢測方法的比較和驗(yàn)證

蔡 穎 周廣彪 陳文婉 許如蘇

(汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515031)

[目的]比較和驗(yàn)證7種甲型H1N1流感病毒核酸檢測方法,篩選出可用于實(shí)驗(yàn)室日常檢測的方法,并證實(shí)實(shí)驗(yàn)室具有正確操作這些方法的能力。[方法]應(yīng)用7種方法檢測甲型H1N1流感病毒核酸,包括5種SYBR Green I熒光RT-PCR法和2種Taqman探針熒光RT-PCR法的商業(yè)試劑盒,用于方法比較和驗(yàn)證的參考樣品包括豬流感H1N1病毒核酸、2009年新甲型H1N1流感病毒核酸、能力驗(yàn)證樣品等不同來源的核酸。[結(jié)果]2種預(yù)期用于豬流感H1N1病毒核酸檢測的SYBR Green I熒光RT-PCR法均能達(dá)到預(yù)期目的;3種預(yù)期用于2009年新甲型H1N1流感病毒核酸檢測的SYBR Green I熒光RT-PCR法均無法區(qū)分2009年新甲型H1N1流感病毒核酸和豬流感H1N1病毒核酸;2種Taqman探針熒光RT-PCR試劑盒均能正確檢出2009年新甲型H1N1流感病毒核酸,但只有1種可檢出能力驗(yàn)證陽性樣品。[結(jié)論]5種SYBR Green I熒光RT-PCR法中有2種能用于豬流感H1N1病毒核酸的檢測,另外3種不能用于新甲型H1N1流感病毒核酸的檢測;2種Taqman探針熒光RT-PCR法的商業(yè)試劑盒能用于2009年新甲型H1N1流感病毒核酸的檢測。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR;甲型H1N1流感病毒;檢測;比較;方法證實(shí)

1 前言

2009年3月以來,一種新型甲型H1N1流感首先在墨西哥、美國等國家發(fā)生爆發(fā)流行[1],隨后在世界范圍內(nèi)迅速蔓延[2]。此次流行的甲型H1N1流感病毒是一種新型病毒,其基因組內(nèi)存在四源重配,其中PB2和PA基因源自禽流感H1N1病毒,PB1基因源自人季節(jié)性流感H3N2病毒,HA、NP和NS基因源自古典型豬流感H1N1病毒,NA及M基因源自歐亞系豬流感H1N1病毒[3,4]。為篩查流感可疑病例,控制流感疫情蔓延,同時(shí)監(jiān)測這種新型病毒在動物中流行情況,迫切需要開發(fā)針對這種新型甲型H1N1流感病毒的檢測方法。WHO、中國疾病預(yù)防控制中心先后發(fā)布了相關(guān)的檢測方法熒光RT-PCR和普通RT-PCR方法[5,6]。對于基層檢測機(jī)構(gòu),通常只需要進(jìn)行少數(shù)樣本的篩查,無需進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn),如果完全按WHO、中國疾病預(yù)防控制中心的檢測方法,需進(jìn)行多個RT-PCR反應(yīng),合成標(biāo)記的引物探針較多,檢測成本比較高,工作量也較大,因此,成本相對低廉的SYBR Green I熒光RT-PCR法成為一種可供選擇的替代方法。另外,不少試劑公司開發(fā)了相關(guān)熒光RT-PCR檢測試劑盒,多數(shù)試劑盒只需進(jìn)行一次反應(yīng)即可得出初步結(jié)果,為基層檢測機(jī)構(gòu)的初篩提供了其他選擇。按ISO/IEC 17025:2005的規(guī)定,實(shí)驗(yàn)室在引進(jìn)新的標(biāo)準(zhǔn)方法之前需進(jìn)行能力證實(shí)。為此,本實(shí)驗(yàn)室利用保存的豬流感H1N1病毒核酸、2009年新甲型H1N1流感病毒核酸等參考標(biāo)準(zhǔn),對本室建立的5個SYBR Green I熒光RT-PCR法以及深圳太太基因工程有限公司、廣州千江企業(yè)有限制公司的2個試劑盒進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)比較和驗(yàn)證,篩選出可用于實(shí)驗(yàn)室日常檢測的方法,并證實(shí)本室有能力正確應(yīng)用該方法進(jìn)行檢測。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 參考樣品

2009年新甲型H1N1流感病毒核酸:由相關(guān)友好單位惠贈;豬流感H1N1亞型滅活病毒核酸:購自哈爾濱獸醫(yī)研究所;2份試劑盒陽性對照:分別來自于深圳太太基因工程有限公司(以下簡稱“深圳太太”)、廣州千江企業(yè)有限公司(以下簡稱“廣州千江”),簡稱“太太陽性”和“千江陽性”;6份CNAS能力驗(yàn)證樣品:由2009年CNAS甲型H1N1流感病毒核酸檢測能力驗(yàn)證(CNAS T0459)提供者北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心分發(fā),指導(dǎo)書中標(biāo)明樣品為體外合成的HA、NA和M基因全序列RNA,編號分別為0206、0324、0387、0424、0540、0674,樣品指定值由能力驗(yàn)證提供者在能力驗(yàn)證完成若干時(shí)間后通知本室。

2.1.2 SYBR Green I熒光RT-PCR引物

序列分別來自于WHO[5]、中國疾病預(yù)防控制中心[6]和張春明[7],見表1,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 SYBR Green I熒光RT-PCR引物序列

2.1.3 試劑

2種甲型H1N1流感病毒熒光PCR檢測試劑盒分別由“深圳太太”、“廣州千江”提供試用裝,“深圳太太”試劑盒生產(chǎn)日期為2009.8.10,“廣州千江”試劑盒生產(chǎn)日期為2009.8.11;One Step SYBR?Prime Script?RT-PCR Kit購于寶生物工程(大連)有限公司,RNA提取液為“深圳太太”試劑盒內(nèi)所配。2.1.4 儀器

Smart Cycler II熒光PCR儀:美國Cephied公司產(chǎn)品。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 RNA提取

按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19438.1-2004《禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法》進(jìn)行。

2.2.2 SYBR Green I熒光RT-PCR條件

反應(yīng)體系總體積為20μL,包括One Step SY BR?RT-PCR Buffer Ⅲ10μL、上下游引物各0.4μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.4μL、Prime Script RT Enzyme Mix Ⅱ0.4μL、RNA模板5μL、DEPC H2O 3.6μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?42℃10 min,95℃1 min→(95℃10s,61℃30s,72℃1min)×5→(95℃10s,60℃45s,78℃6s采集熒光)×40→熔解曲線檢測(程序一)。

2.2.3 Taqman熒光RT-PCR擴(kuò)增程序

(1)按GB/T 19438.1-2004進(jìn)行:42℃10 min,95℃1 min→(95℃10s,45℃30s,72℃1min)×5→(95℃10s,60℃30s采集熒光)×40(程序二);

(2)42℃10 min,95℃1 min→(95℃10s,61℃30s,72℃1min)×5→(95℃10s,60℃45s,78℃6s采集熒光)×40(程序三)。

使用“深圳太太”試劑盒擴(kuò)增以下稱為方法6,使用“廣州千江”試劑盒擴(kuò)增以下稱為方法7。

3 結(jié)果

3.1 SYBR Green I熒光RT-PCR檢測結(jié)果

5種SYBR Green I熒光RT-PCR法全部能檢出豬流感H1N1病毒核酸,但其中僅有方法1、2能正確檢出2009年新甲型H1N1流感病毒核酸;方法5對新甲型H1N1流感病毒核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物與參考標(biāo)準(zhǔn)的Tm值比較接近,但仔細(xì)分析還是略有差別,應(yīng)為非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。見表2、圖1、圖2。

表2 SYBR Green I熒光RT-PCR檢測結(jié)果

圖1 SYBR Green I熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線圖

3.2 2種Taqman熒光RT-PCR試劑盒檢測結(jié)果

2種Taqman探針熒光RT-PCR法商業(yè)試劑盒都能檢出2009年新甲型H1N1流感病毒核酸,也能檢出自身所配陽性對照,但均無法檢出非已方試劑盒的陽性對照和豬流感H1N1病毒核酸,見表3。

圖2 SYBR Green I熒光RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線圖

表3 2種Taqman熒光RT-PCR試劑盒檢測結(jié)果(Ct值)

3.3 能力驗(yàn)證樣品檢測結(jié)果

“深圳太太”試劑盒擴(kuò)能正確檢測能力驗(yàn)證樣品中的4個陽性和2個陰性;“廣州千江”試劑盒的所有樣品檢測結(jié)果均為陰性,見表4和圖3。

表4 能力驗(yàn)證樣品檢測結(jié)果(Ct值)

圖3 Taqman熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線圖

4 討論

4.1 新方法開檢能力證實(shí)

ISO/IEC 17025:2005條款5.4.2規(guī)定,“在引入檢測或校準(zhǔn)之前,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)證實(shí)能夠正確地運(yùn)用這些標(biāo)準(zhǔn)方法”。本研究中的7種方法有些來源于權(quán)威機(jī)構(gòu),有些來源于經(jīng)審核獲通過的學(xué)位論文,還有些來源于經(jīng)過一定程序驗(yàn)證的商業(yè)試劑盒,但要在本室正式使用,仍需進(jìn)行方法證實(shí)。但方法證實(shí)不同于方法確認(rèn),方法證實(shí)側(cè)重于證實(shí)能正確應(yīng)用,僅需要按程序檢測陰陽性對照,能得出正確結(jié)果即可,不需要象方法確認(rèn)那樣,可能只有少數(shù)具備較高水平技術(shù)人員、具備較為完備的各種陰陽性對照的實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行。因此,本實(shí)驗(yàn)室只是簡單地應(yīng)用新甲型H1N1流感病毒核酸、豬流感H1N1亞型滅活病毒核酸、能力驗(yàn)證中陽性樣品作為陽性對照,新城疫病毒核酸、能力驗(yàn)證中陰性樣品作為陰性對照,按程序進(jìn)行檢測,就可滿足ISO/IEC 17025:2005中關(guān)于方法證實(shí)的要求。

4.2 SYBR Green I熒光RT-PCR法

常規(guī)RT-PCR方法的靈敏度比Taqman熒光RT-PCR方法低,而且需要制膠、跑膠、拍照等,方法比較繁瑣,還有接觸有毒物質(zhì)溴乙錠的危險(xiǎn),出于實(shí)驗(yàn)室安全管理的考慮,應(yīng)盡可能選用替代方法。SYBR Green I熒光RT-PCR就是一種不錯的替代方法,可直接使用常規(guī)RT-PCR方法的引物,無需接觸溴乙錠,操作上與Taqman熒光RT-PCR方法一樣簡便,也可實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增結(jié)果。雖然無法檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小,同時(shí)SYBR Green I與雙鏈DNA的結(jié)合又是非特異性,但仍可通過熔解曲線區(qū)分非特異性信號和特異性信號。實(shí)驗(yàn)過程中筆者發(fā)現(xiàn),非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(多數(shù)低于80℃)較特異性產(chǎn)物熔解溫度低(多數(shù)高于80℃),這與文獻(xiàn)[9]的描述一致。因此,可以通過提高信號采集溫度來消除非特異性擴(kuò)增曲線的出現(xiàn),所以本研究采用了78℃而不是常用的60℃作為信號采集時(shí)的溫度。

本研究建立的5種SYBR Green I熒光RTPCR法中,方法1、2、3中使用的引物原用于新甲型H1N1流感病毒核酸的探針法熒光RT-PCR檢測[5,6],方法4、5使用的引物原用于豬流感H1N1病毒核酸的探針法熒光RT-PCR檢測[7],選擇探針法熒光RT-PCR的引物的優(yōu)點(diǎn)在于,需要時(shí)可隨時(shí)合成探針,與這些引物組合用于探針法熒光RTPCR檢測。本研究的結(jié)果顯示,這些引物用于SYBR Green I熒光RT-PCR檢測基本取得了預(yù)期的效果。如方法1、2可正確檢出新甲型H1N1流感病毒核酸,方法4、5則可正確檢出豬流感H1N1病毒核酸。不過,也出現(xiàn)了一些預(yù)期外的結(jié)果,如方法3無法檢出新甲型H1N1流感病毒核酸,但能檢出豬流感H1N1病毒核酸;方法1、2也可檢出豬流感H1N1病毒核酸;方法5也可檢出新甲型H1N1流感病毒核酸。方法3出現(xiàn)預(yù)期外的結(jié)果的原因可能是,本研究的豬流感H1N1病毒核酸中正好與方法3的引物完全吻合,而本研究的新甲型H1N1流感病毒核酸正好在引物區(qū)變異,導(dǎo)致完全沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)作者使用美國國立衛(wèi)生研究院的網(wǎng)上BLAST軟件進(jìn)行搜索后,發(fā)現(xiàn)這對引物雖然吻合的序列多數(shù)為新甲型H1N1流感病毒株,但也有個別豬流感H1N1病毒株核酸可完全吻合。同時(shí)也證明該對引物的特異性尚不十分理想。方法1、2也可檢出豬流感H1N1病毒核酸的原因是這段引物的序列正好也與豬流感H1N1病毒核酸的序列完全吻合,而原文獻(xiàn)的探針對應(yīng)的序列正好為新甲型H1N1流感病毒株的特異性序列,所以原文獻(xiàn)的探針法熒光RT-PCR可以特異性地檢出新甲型H1N1流感,但僅使用其引物的SYBR Green I熒光RT-PCR則無法區(qū)分這兩種流感病毒核酸。經(jīng)作者使用網(wǎng)上BLAST軟件進(jìn)行搜索后,也證實(shí)了這個猜想。方法5雖然檢出新甲型H1N1流感病毒核酸,但仔細(xì)分析其熔解曲線及Tm值,兩種病毒核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的的熔解曲線不同,Tm值也略有差別,說明擴(kuò)增產(chǎn)物不完全相同。

4.3 Taqman探針熒光RT-PCR法

Taqman探針熒光RT-PCR法具有特異性強(qiáng)、快速、靈敏、條件優(yōu)化較為簡單等優(yōu)點(diǎn),而且可以通過多色熒光PCR同時(shí)檢測多個基因片段,但缺點(diǎn)是方法開發(fā)及檢測的成本均比較高。對于檢測樣品不太多的基層檢測機(jī)構(gòu),使用商業(yè)化試劑盒是一個不錯的選擇。但對于新甲型H1N1流感病毒這類高致病性病原核酸的檢測,由于普通試劑公司缺乏合適的陽性對照,其試劑盒的有效性還需檢測機(jī)構(gòu)的驗(yàn)證或證實(shí)。本研究的結(jié)果顯示,兩個試劑盒均能正確檢測各自試劑盒內(nèi)陽性對照,說明其內(nèi)部質(zhì)控都控制得不錯;都不能檢出非己方的試劑盒陽性,是因?yàn)樵噭┖兄械年栃詫φ詹⒎遣《镜幕蚪MRNA,而是體外合成的RNA片段,正好不包含與對方引物吻合的片段?？偣卜謩e檢測新甲型H1N1流感病毒核酸3次,均為陽性,檢測豬流感H1N1病毒核酸均為陰性,說明這兩個試劑盒均可用于新甲型H1N1流感病毒核酸的檢測。

4.4 能力驗(yàn)證樣品

經(jīng)中國實(shí)驗(yàn)室國家認(rèn)可委員會(CNAS)認(rèn)可的能力驗(yàn)證提供者在組織能力驗(yàn)證時(shí)提供給參加單位的樣品均經(jīng)過嚴(yán)格的穩(wěn)定性、均勻性檢測,可以作為基層檢測機(jī)構(gòu)難得的參考樣品。雖然數(shù)量有限,但還是可以在方法證實(shí)甚至在方法確認(rèn)中起到不小的作用。本研究結(jié)果顯示,“深圳太太”試劑盒擴(kuò)能正確檢測能力驗(yàn)證樣品中的4個陽性和2個陰性;“廣州千江”試劑盒的所有樣品檢測結(jié)果均為陰性。這個結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了“深圳太太”試劑盒對新甲型H1N1流感病毒核酸的檢測能力。但“廣州千江”試劑盒是否就不能用于新甲型H1N1流感病毒核酸的日常檢測了呢?實(shí)際上,出于生物安全考慮,所有6個能力驗(yàn)證樣品均為體外合成的HA、NA和M基因全序列RNA,而不是病毒的基因組RNA,推測“廣州千江”試劑盒檢測的目標(biāo)序列位于這3個基因之外的序列上。

5 結(jié)論

本文初步證實(shí)了方法4、5檢測豬流感H1N1病毒核酸及2個Taqman探針熒光RT-PCR試劑盒檢測新甲型H1N1流感病毒核酸的有效性;證實(shí)了本室正確運(yùn)用這4種方法的能力;證實(shí)方法1、2、3不能用于新甲型H1N1流感病毒核酸的檢測。

[1] World health Organization.Pandemic(H1N1)2009-update 31.17 May 2009[EB/OL].http://www.who.int/csr/don/2009_05_17/en/index.html.

[2] World Health Organization.Pandemic(H1N1)2009-update 64.04 September 2009[EB/OL].http://www.who.int/csr/don/2009_09_04/en/index.html.

[3] Novel Swine-Origin Influenza A(H1N1)Virus Investigation Team.Emergence of a Novel Swine-Origin Influenza A(H1N1)Virus in Humans[J].N.Engl.J.Med,2009,360(25):2605-2615.

[4] Garten R J,DavisC T,RussellC A,et al.Antigenic and genetic characteristics of s wine-origin 2009 A(H1N1)influenza viruses circulating in humans[J].Science,2009,325(5937):197-201.

[5] CDC protocol of real time RT-PCR for influenza A(H1N1)[EB].http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html.

[6] 甲型H1N1流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)方案[EB/OL].http://www.chinacdc.cn/n272442/n272530/n273736/n273781/n4624704/n4661330/appendix/fangan.doc.

[7] 張春明.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)快速定量檢測H3N2、H1N1和H1N2亞型豬流感病毒[D].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文.2008:32.

[8] CNAS-CL01檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則(ISO/IEC 17025:2005)[S].

[9] Bustin SA.Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays[J].J.Mo1.Endocrinol,2000,25(2):169-193.

The Comparison and Validation of 7 Methods for the Detection of Nucleic Acid from H1N1

Influenza A Virus

Cai Ying,Zhou Guang biao,Chen Wenwan,Xu Rusu
(Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shantou,Guangdong,515031)

[Objectives]To compare and validate 7 methods for the detection of nucleic acid from H1N1 influenza A virus,select suitable methods for routine detection in lab,and prove that our lab can properly operate these methods.[Methods]7 methods were compared and validated,including 5 SYBR Green I fluorescent RT-PCR methods and 2 Taqman fluorescent RT-PCR commercial kits.The reference samples were nucleic acid from swine influenza A virus H1N1,2009 novel H1N1 influenza A virus and 6 samples from CNAS proficiency test.[Results]The 2 SYBR Green I fluorescent RT-PCR methods anticipated for detection of the nucleic acid from s wine influenza A virus H1N1 works well;none of the 3 SYBR Green I fluorescent RT-PCR methods anticipated for detection of the nucleic acid from 2009 novelH1N1 influenza were unable to distinguish the 2009 novelH1N1 influenzaA virus from swine influenzaA virusH1N1.The 2 Taqman fluorescent RT-PCR commercial kits indicated good results for detecting 2009 novel H1N1 influenza,but only one read a correct result for detecting H1N1 samples in one proficiency test.[Conclusions]Among 5 SYBR Green I fluorescent RT-PCR methods,2 methods can be used in the detection of nucleic acid from swine influenza A virus H1N1,and other 3 methods are not proper for detecting 2009 novel H1N1 influenza A virus,while 2 Taqman fluorescent RT-PCR commercial kits can be used for detection of nucleic acid from 2009 novel H1N1 influenza A virus.

Real Time RT-PCR;Influenza A(H1N1)Virus;Detection;Validation;Confirmation of Method

Q939.47;R373.1