楊新河，李 勤，黃建安，陸 英，沈 智，劉仲華,*

(1.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.孝感學院生命科學技術(shù)學院，湖北 孝感432000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128)

普洱茶茶色素提取工藝條件的響應面分析及其抗氧化性活性研究

楊新河1,2，李 勤1,3，黃建安1,3，陸 英1,3，沈 智1,3，劉仲華1,3,*

(1.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.孝感學院生命科學技術(shù)學院，湖北 孝感432000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128)

目的：優(yōu)化普洱茶茶色素的提取工藝及研究其抗氧化性活性。方法：以與蒸餾水的色差作為普洱茶茶色素提取的評價指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合試驗和響應面分析法，對普洱茶茶色素提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化；以清除1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH自由基)的能力評價普洱茶茶色素的抗氧化性活性。結(jié)果：普洱茶茶色素提取的最佳工藝條件為液料比45:1(mL/g)、提取溫度100℃、提取時間150min、色差52.97，高出單因素試驗和Box-Behnken組合中的最高色差4.73%；普洱茶茶色素清除DPPH自由基的IC50值30.83μg/mL。結(jié)論：采用響應曲面法對普洱茶茶色素提取條件進行優(yōu)化可行；普洱茶茶色素具有良好的抗氧化作用，可作為天然抗氧化劑進一步開發(fā)和利用。

普洱茶；茶色素；提??；響應面分析；抗氧化性活性

普洱茶是以云南省一定區(qū)域內(nèi)的云南大葉種曬青毛茶為原料，經(jīng)過后發(fā)酵加工成的散茶和緊壓茶[1]。研究表明，普洱茶具有降血脂、降血糖、抗突變、防癌及防治心血管疾病等功能[2-13]。普洱茶藥理作用的主要成分是茶多酚、茶色素和茶多糖等[1]。普洱茶茶色素是指從普洱茶中提取的一類水溶性酚性色素，屬于天然色素，包括茶黃素類(TFs)、茶紅素類(TRs)和茶褐素類(TBs)，其中茶褐素類是其主體成分。而茶褐素類比茶紅素類更復雜，為高聚物，極性很大，分離純化的難度極大，根本不清楚其組成、性質(zhì)及分離制備等，急需開展茶褐素類的相關(guān)研究?，F(xiàn)有一些研究初步表明：普洱茶茶色素具有防癌抗癌、防紫外線照射、抗動脈粥樣硬化等藥效，產(chǎn)品的開發(fā)可廣泛用于醫(yī)藥和食品工業(yè)[14]。但普洱茶茶色素的藥理作用機理并不清楚、新的功效有待挖掘，應用領(lǐng)域需要拓展。因此，如何有效充分提取普洱茶茶色素是深入研究其化學成分、構(gòu)效關(guān)系及產(chǎn)生更大經(jīng)濟效益等諸多方面的前提。

目前，茶葉中色素類物質(zhì)TFs、TRs和TBs的含量采用系統(tǒng)分析法測定[15]，但此方法不能夠?qū)嵘氐男ЧM行快速評價。而色差E測量原理采用最廣泛使用于測量物體色調(diào)的CIEL*a*b*顏色空間(即色度空間)系統(tǒng)。所有的顏色可用L*、a*、b*三個軸的坐標來定義。L*為垂直軸，代表明度，其值從底部0(黑)到頂部100(白)。a*代表紅綠軸上顏色的飽和度，其中－a*為綠、+a*為紅。b*代表藍黃軸上顏色的飽和度，其中－b*為藍、+b*為黃。a*、b*都是水平軸。2個顏色之間的E=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2。測定溶液與蒸餾水標準液的E值，則E值的大小反映了溶液色素質(zhì)量濃度的大小，從而可以簡單快速評價不同浸提條件對提取色素效果的影響。本實驗采用E值作為普洱茶茶色素提取的評價指標，研究熱水提取茶色素過程中液料比、提取溫度和提取時間對茶色素提取的影響。在此基礎(chǔ)上，利用響應面分析法對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得出普洱茶茶色素水提法的最佳工藝條件；同時利用清除1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH自由基)法研究普洱茶茶色素的抗氧化作用，旨在為深入研究普洱茶茶色素提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍潤普洱茶(2007年) 云南龍潤茶業(yè)集團。

1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH自由基) 日本東京化成工業(yè)株式會社；其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平 瑞士Startorius公司；恒溫水浴鍋北京國華醫(yī)療器械廠；SMY-2000ST測色色差計 北京盛名揚科技開發(fā)有限責任公司；Rotavapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士B公司；循環(huán)水式多用真空泵 河南鞏義英峪予華儀器；Modulyod-230型冷凍干燥機 美國熱電公司；UV-2550型紫外分光光度計 日本島津儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 普洱茶茶色素TFs、TRs和TBs的含量測定

采用系統(tǒng)分析法[15]測定。

1.3.2 普洱茶茶色素的E測定方法

普洱茶經(jīng)粉碎，篩分，烘干，無水乙醚脫脂，備用。精密稱取一定量的普洱茶脫脂樣品于150mL浸提瓶中，加入一定體積的熱水在100℃條件下浸提，每隔20min振搖10s，浸提2h，過濾，濾液濃縮，凍干，取凍干粉配制成系列梯度質(zhì)量濃度的溶液，再經(jīng)色差計測定與蒸餾水的E值，計算出與色素質(zhì)量濃度呈線性正相關(guān)的E值范圍。樣品浸提所得濾液定容至250mL，測定與蒸餾水的E值大小評價色素提取的高低。

1.3.3 普洱茶茶色素的提取

精密稱取普洱茶脫脂樣品1.250g于150mL浸提瓶中，加入一定體積的熱水在相應溫度下浸提，每隔2 0 min振搖1 0 s，浸提完畢后，過濾，濾液定容至250mL，再經(jīng)色差計測定與蒸餾水的E值。試驗分別考察了溫度、液料比和提取時間對E值的影響，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取溫度、液料比和提取時間3個因素的合適水平進行Box-Behnken中心組合設(shè)計，采用響應面分析法對提取工藝進行優(yōu)化。

1.3.4 普洱茶茶色素清除DPPH自由基能力

按照優(yōu)化的提取工藝浸提普洱茶茶色素，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)真空濃縮至一定體積，冷凍干燥，取凍干粉用蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度的樣品液。參照文獻[16]，分別取2mL樣品液于試管中，加入2mL 2×10-4mol/L DPPH自由基溶液(無水乙醇配制)，混合均勻，反應30min后在波長518nm處測定其吸光度A1，以2mL水代替樣品測定吸光度為A0；以2mL樣品與2mL無水乙醇混合液為A2，以消除樣品本身的影響，以2mL水與2mL無水乙醇的混合液調(diào)零點。按下式計算清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶中TFs、TRs和TBs的含量

普洱茶中茶色素TFs、TRs和TBs含量(占干物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù))分別為0.298%、2.19%、12.02%。普洱茶中茶色素以TBs含量最高，遠遠高于TRs和TFs，而TFs的含量很低。TFs、TRs和TBs都是茶多酚的不同程度的氧化產(chǎn)物，三者含量的高低與普洱茶獨特的后發(fā)酵過程密切相關(guān)，即在整個“后發(fā)酵”過程中多酚類物質(zhì)經(jīng)過酶促氧化和弱非酶促氧化聚合后，先產(chǎn)生茶黃素類、茶紅素類，再進一步氧化聚合生成茶褐素類物質(zhì)，而茶褐素則大幅度增加，是形成普洱茶色澤的主要原因。

2.2 普洱茶茶色素的E值與質(zhì)量濃度的關(guān)系

配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的色素溶液，用色差計測定與蒸餾水的E值依次為21.98、36.07、50.32、67.30和82.14。以色素質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標X、以E值為縱坐標Y進行線性回歸，方程為Y=30.31X+6.097，相關(guān)系數(shù)R2=0.9989，色素在0.5～2.5mg/mL范圍內(nèi)與E值在21.98～82.14之間呈良好的線性關(guān)系，如圖1所示。因此，用色差計測定色素溶液的E值在21.98～82.14范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)能夠正確評價色素含量的高低。

圖1 E值與茶色素質(zhì)量濃度的相關(guān)圖Fig.1 Relationship between color differenceEvalue and Pu-erh tea pigment concentration

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取溫度對普洱茶茶色素提取E值的影響

固定茶色素提取的液料比35:1、時間1h，以提取溫度對茶色素提取E值做單因素試驗。設(shè)計提取溫度60、70、80、90、10 0℃，結(jié)果見圖2。

圖2 提取溫度對普洱茶茶色素提取E值的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

由圖2可知，隨著溫度在60～100℃之間的升高，普洱茶茶色素提取E值增加顯著，其原因可能與溫度越高，茶色素擴散到溶劑中的速度越快及普洱茶中本身含有的簡單多酚氧化轉(zhuǎn)化為聚合多酚形式的茶色素越多有關(guān)。從實際生產(chǎn)情況考慮，提取溫度不宜超過100℃。

2.3.2 液料比對普洱茶茶色素提取E值的影響

固定茶色素提取的溫度80℃、時間1h，以液料比對茶色素提取E值做單因素試驗。設(shè)計液料比15:1、25:1、35:1、45:1、55:1(mL/g)，結(jié)果見圖3。

圖3 不同液料比對普洱茶茶色素提取E值的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

由圖3可知，液料比的增大對提高普洱茶茶色素提取E值的效果較為明顯，在15:1～45:1之間，E值呈直線上升趨勢，而在45:1～55:1之間茶色素提取E值變化平緩且略有下降。這可能是由于普洱茶需要吸收較多水分，才能充分溶脹，有利于色素的溶出；當液料比達到45:1時，色素充分溶出，但繼續(xù)增加溶劑比例后，其他成分過多溶出反而不利于色素的提取。考慮到降低后續(xù)工序濃縮的能耗及提高效率，液料比應控制在45:1以內(nèi)。

2.3.3 提取時間對普洱茶色素提取E值的影響

固定茶色素提取的液料比35:1、溫度80℃，以提取時間對茶色素提取E值做單因素試驗。設(shè)計提取時間30、60、90、120、150min，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時間對普洱茶茶色素提取E值的影響Fig.4 Effect of extraction time on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

由圖4可知，提取時間的延長對提高普洱茶色素提取E值的效果有一定的影響，在30～120min之間，E值呈上升趨勢，而在120～150min之間E值趨于平緩。因此，提取時間宜控制在90～150min內(nèi)。

2.4 采用響應面法優(yōu)化普洱茶茶色素的提取工藝

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取液料比、溫度、時間3個因素的合適水平，對提取工藝進行響應面分析，其具體試驗方案及結(jié)果見表1、2。

表1 普洱茶茶色素的提取響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels in response surface design for optimizing the extraction of Pu-erh tea pigment

表2 普洱茶茶色素的提取響應面分析方案及其計算分析結(jié)果Table 2 Scheme and results of response surface design for optimizing the extraction of Pu-erh tea pigment

運用Minitab 14數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件，使用未編碼單位對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果見表3，得到液料比、溫度、時間的二次多項回歸模型。

表3 回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Regression coefficients and significance test for the constructed quadratic polynomial model equation

由表3可以看出，根據(jù)P值判斷(P＜0.05時水平顯著)，各因素中一次項X2和二次項X22是最為顯著的，其次是交互項X1X3，由此可見，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表4 回歸方程方差分析表Table 4 Analysis of variance for the regression equation

表4回歸方程方差分析表明，方程二次項影響是最為顯著的，一次項影響也是極為顯著的，交互項影響相對不顯著，說明響應值的變化相對復雜。R2=0.9942較大，說明二次多項式回歸效果比較好，失擬項為0.349不顯著，說明回歸方程擬合程度良好。

圖5 提取E值殘差分析圖Fig.5 Residual plot for color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

對響應數(shù)據(jù)(E值)進行殘差分析，殘差值分析結(jié)果見圖5，表明模型(1)能在很大程度上解釋觀測數(shù)據(jù)(E值)中的變異。

模型(1)的響應曲面及其等高線見圖6，3組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。由圖6可以看出溫度對色素提取E值的影響最為明顯，以液料比與時間的交互作用較大，但未達到顯著水平。從圖6也可以看出，當一個因素的水平固定為1時，能夠預測另兩個因素取不同水平組合的E值大小。因此，色素提取可以依據(jù)模型(1)的響應曲面及其等高線圖，在實際生產(chǎn)中從能耗、效率及經(jīng)濟效益等多方面綜合考慮來合理選擇3因素的水平組合。

圖6 各兩因素交互作用的響應曲面和等值線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature, extraction time and liquidto-material ratio on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

單純從色素提取的E值大小考慮，用Mintab 14軟件進行分析，則可以求得最適的提取條件為X1=45:1、X2=100℃、X3=150min，預測色素提取的E值為52.29，在此條件下進行驗證實驗，重復3次，取平均值，提取液中E值為52.97，相對標準偏差為1.37%，與預測值相差1.3%，高出單因素試驗和Box-Behnken組合中的最高E值4.73%。因此，基于響應曲面法所得的優(yōu)化工藝參數(shù)準確可靠。

2.5 普洱茶茶色素清除DPPH自由基能力

DPPH自由基在國內(nèi)外廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究與天然抗氧化劑的篩選。若受試物能將其清除，則表明受試物具有降低羥基自由基、烷基自由基或過氧化自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈的作用[17]。普洱茶茶色素對DPPH自由基的清除結(jié)果見圖9，可知樣品質(zhì)量濃度在10～60μg/mL范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除率呈線性正相關(guān)，普洱茶茶色素清除DPPH自由基的IC50值為30.83μg/mL。普洱茶茶色素清除DPPH自由基的能力可能與其結(jié)構(gòu)中的一些活性酚羥基和苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖7 普洱茶茶色素對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging rates of Pu-erh tea pigment at various concentrations on DPPH free radicals

3 結(jié) 論

3.1 以與蒸餾水的E值作為色素提取的評價指標，基于試驗設(shè)計軟件Minitab 14，通過二次回歸設(shè)計得到了普洱茶茶色素提取E與料液比、提取溫度、提取時間的回歸模型，利用響應優(yōu)化器得到色素提取E值的優(yōu)化工藝參數(shù)為液料比45:1(mL/g)、提取溫度100℃、提取時間150min，色素提取E值52.97，相對標準偏差為1.37%，與預測值相差1.3%，高出單因素試驗和Box-Behnken組合中的最高E值4.73%。因此，利用響應面分析方法對普洱茶茶色素提取工藝進行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效減少工藝操作的盲目性，從而為進一步的實驗研究提供參考。

3.2 按照普洱茶茶色素提取的優(yōu)化工藝提取得到的干燥產(chǎn)品清除DPPH自由基的體外抗氧化性實驗，可知普洱茶茶色素具有良好的抗氧化作用，清除DPPH自由基的IC50為30.83μg/mL，普洱茶茶色素可以作為一種天然的抗氧化劑。

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Optimization of Process Conditions for Pu-erh Tea Pigment Extraction by Response Surface Analysis and Its Antioxidant Activity

YANG Xin-he1,2，LI Qin1,3，HUANG Jian-an1,3，LU Ying1,3，SHEN Zhi1，LIU Zhong-hua1,3,*
(1. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Botanical Functional Ingedients, Changsha 410128,China；2. College of Life Science and Technology, Xiaogan University, Xiaogan 432000, China；3. Key Laboratory of Tea Science, Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Objective: To optimize the extraction process for Pu-erh tea pigment and explore its antioxidant activity. Methods:Following single factor investigations, optimization of process conditions for the extraction of Pu-erh tea pigment based on the color difference valueEbetween distilled water and Pu-erh tea pigment was carried out using central design composite design combined with response surface methodology (RSM). 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay was used to evaluate the antioxidant activity of the pigment. Results: The optimal extraction conditions for Pu-erh tea pigment were liquid-to-material ratio of 45:1 (mL/g), extraction temperature of 100 ℃ and extraction time of 150 min. Under the optimal extraction conditions, a color differenceEvalue of 52.97 was obtained, which revealed 4.73% increase as compared to the highest color difference in single-factor investigations and Box-Behnken composite experiments. The IC50 value for the scavenging capability of Pu-erh tea pigment on DPPH free radicals was 30.83 μg/mL. Conclusion: It is feasible to optimize the extraction of Pu-erh tea pigment by response surface methodology. The Pu-erh tea pigment with excellent antioxidant activity has the potential to be further developed and utilized as a natural antioxidant.

Pu-erh tea；tea pigment；extraction；response surface methodology；antioxidant activity

S571.1

A

1002-6630(2011)06-0001-06

2010-04-21

“十一五”國家科技支撐計劃重大項目(2007BAD58B00-03)；云南省政府茶葉專項(2007YNCXB-01-01)

楊新河(1974—)，男，講師，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：yangxinhe@163.com

*通信作者：劉仲華(1965—)，男，教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：Larkin-liu@163.com