于殿宇，王騰宇，陳 昊，朱秀清，江連洲，，胡立志，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

生物酶法合成植物甾醇酯的研究

于殿宇1，王騰宇1，陳 昊2，朱秀清2，江連洲1，2，胡立志2，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

采用生物酶法對(duì)葵花油與植物甾醇的酯交換反應(yīng)技術(shù)參數(shù)和條件進(jìn)行了探索。采用Novozym 435脂肪酶，催化植物甾醇與油脂的酯交換反應(yīng)。通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)，確定了最佳工藝參數(shù):甾醇濃度5%，酶添加量1%，反應(yīng)時(shí)間3h，反應(yīng)溫度100℃，攪拌速度600r/min，在最佳條件下酯交換反應(yīng)的酯化率達(dá)到89.7%。

植物甾醇，葵花油，酯交換反應(yīng)，脂肪酶

甾醇(sterol)又被稱為類固醇(steroids)，是天然有機(jī)物質(zhì)中的一大類，動(dòng)植物組織都有。動(dòng)物體內(nèi)普遍含有膽甾醇，一般稱為膽固醇(cholesterol);植物中的膽甾醇含量很少，主要為植物甾醇。至今已發(fā)現(xiàn)100多種植物甾醇，含量較豐富的，主要包括β－谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等［1－2］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與膽固醇非常相似，僅側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同。自從植物油中發(fā)現(xiàn)谷甾醇等植物甾醇以來，近百年來人們對(duì)植物甾醇進(jìn)行了廣泛深入的探討，甾醇也被譽(yù)為“生命的鑰匙”［3］。甾醇為白色結(jié)晶，具有旋光性，不溶于水，易溶于二硫化碳、氯仿、乙醚、苯等溶劑，難溶于乙醇和丙酮，不溶于水、酸和堿。其分子所含的碳原子數(shù)一般為27～31個(gè)，分子量大致為386～456，熔點(diǎn)均高于100℃。植物甾醇的生理功能十分重要，如降膽固醇、抗癌作用、類激素功能、抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、抗病毒等［4］，所以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。并且由于其是一種W/O型乳化劑，可以很好地提高乳化穩(wěn)定性和對(duì)皮膚溫和的滲透力，也可以作為化妝品的原料，同時(shí)由于其無毒無害，也廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)、飼料行業(yè)和印刷行業(yè)等。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，居民生活水平的不斷提高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)血脂異?？偦疾÷蕿?8.6%;18歲以上血脂異常人數(shù)已達(dá)到1.6億，并且這一數(shù)字還在不斷增加。大量的流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)室研究證明，人體攝入的植物甾醇越多，罹患心腦血管疾病的概率就越低，所以應(yīng)加大植物甾醇的攝入量。人體不能合成植物甾醇，必須從外界攝取，但是由于游離的植物甾醇在水和油脂的溶解度非常低從而大大降低了其生理作用。植物油中甾醇主要以游離形式和脂肪酸酯形式存在［5］，但是植物甾醇酯有更優(yōu)的脂親和性和更佳的降膽固醇效果［6］。2000年FDA批準(zhǔn)植物甾醇酯可作為功能性食品配料。2007年我國(guó)衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)植物甾醇酯為“新資源食品”。含有植物甾醇的保健功能性油脂是植物甾醇和甘三酯的脂肪酸經(jīng)酯化后添加到油脂中的一項(xiàng)新技術(shù)。在我國(guó)人民健康和保健意識(shí)逐漸提高的趨勢(shì)下，開發(fā)具有保健功效的食用油新產(chǎn)品，在提升食用油的健康指標(biāo)，提高居民健康水平和預(yù)防疾病等方面，有著非常重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

植物甾醇 西安藍(lán)天生物工程有限責(zé)任公司;葵花油 大連圣基生物制品有限公司;Novozym 435脂肪酶 丹麥Novozymes公司;其他試劑 均為化學(xué)純。

恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司;DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪高科儀器廠;LD4－2A低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;XW－80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠;722型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物甾醇酯的合成 精確稱量一定量的植物甾醇、葵花油和Novozym 435脂肪酶，連同轉(zhuǎn)子一同加入錐形瓶中，置于集熱式磁力攪拌器中，調(diào)整溫度、攪拌速度，反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)完成后，在3000～4000r/min條件下離心20min，取出上層油脂制品。1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將甾醇溶解于乙酸酐中，配制成濃度為100μg/m L的溶液并吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0m L分別置于10m L試管內(nèi)，在各管內(nèi)加入乙酸酐使總體積均達(dá)到4m L。加入2滴濃硫酸，30min后，在660nm波長(zhǎng)下比色。以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 酯化率的測(cè)定 將制取的植物甾醇酯3～4滴，置于25m L試管內(nèi)，準(zhǔn)確記錄其重量。加入4m L無水乙醇，0.5m L 50%氫氧化鉀溶液，在65℃恒溫水浴中皂化1h。皂化時(shí)每隔20～30min振搖一次使皂化完全。皂化完畢，取出試管，冷卻。加入3m L 5%氯化鈉溶液，10m L石油醚，蓋緊玻塞，在電動(dòng)振蕩器上振搖2min，靜置分層(一般約需1h以上)。

取上層石油醚液2m L，置于10m L試管內(nèi)，在65℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，加?m L乙酸酐，2滴濃硫酸，混勻，靜置20m in后在660nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)得吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的植物甾醇含量。

1.2.4 酯化率的計(jì)算 計(jì)算公式如下:

式中:X－酯化率，%;m－測(cè)得的吸光度值在膽固醇標(biāo)準(zhǔn)線上顯示的膽固醇含量，μg;V－石油醚總體積，m L;V1－取出的石油醚體積，m L;m1－稱取油樣品脂量，g;m2－稱取油脂中植物甾醇量，mg;m3－油脂制品量，g;m4－添加的植物甾醇量，mg;1/1000000－折算成每1g油脂制品植物甾醇酯毫克數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)酯化率的影響 在植物甾醇濃度10%，酶用量1%，轉(zhuǎn)速300 r/m in，反應(yīng)時(shí)間3h的條件下，考察不同溫度對(duì)甾醇酯化率的影響見圖1。酶的最佳反應(yīng)溫度為70～80℃，高溫會(huì)使酶變性失活。但是酶具有被油脂中的游離水激活這一特性，由于油脂中的含水量極低，水分過多反而會(huì)鈍化酶的活性。因此，本實(shí)驗(yàn)中甘三酯的酯交換反應(yīng)可以在含水量非常低而無游離水添加的高溫下反應(yīng)。從圖1可以看出，在60～100℃這一范圍內(nèi)，酯交換隨著反應(yīng)溫度的升高而增加，100～110℃酯化率開始下降。這是因?yàn)槊傅幕钚噪S著溫度的上升而提高，達(dá)到最大適應(yīng)溫度以后，再升高溫度會(huì)使酶變性失活，從而使酯化率下降。因此，選擇反應(yīng)溫度為100℃。

圖1 不同溫度對(duì)酯化率的影響

2.1.2 甾醇濃度對(duì)酯化率的影響 在酶用量1%，轉(zhuǎn)速300r/min，反應(yīng)時(shí)間3h，反應(yīng)溫度100℃的條件下，考察不同甾醇濃度對(duì)甾醇酯交換的影響見圖2。從圖2可以看出，植物甾醇的濃度為5%時(shí)酯化率最高。隨著植物甾醇濃度的增加，酯化率呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物甾醇濃度低于5%時(shí)，反應(yīng)并不完全，超過15%以后，不能完全溶解于葵花油中，酯交換反應(yīng)緩慢。因此，甾醇濃度5%為最佳原料配比。

圖2 不同植物甾醇濃度對(duì)酯化率的影響

2.1.3 酶用量對(duì)酯化率的影響 在植物甾醇濃度5%，轉(zhuǎn)速300 r/m in，反應(yīng)時(shí)間3h，反應(yīng)溫度100℃條件下，考察不同酶用量對(duì)甾醇酯化率的影響見圖3。從圖3可以看出，酶用量為1%時(shí)酯化率最大，隨著酶用量的增加，酯化率呈下降趨勢(shì)。因此，酶用量1%為最佳條件。

圖3 不同酶用量對(duì)酯化率的影響

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化率的影響 在植物甾醇濃度5%，酶用量1%，轉(zhuǎn)速300r/min，反應(yīng)溫度100℃條件下，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)甾醇酯酯化率的影響見圖4。從圖4可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酯化率增加并不十分明顯，并且反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)還有增加發(fā)生副反應(yīng)的機(jī)率。從經(jīng)濟(jì)角度來看，選擇反應(yīng)時(shí)間3h。

2.1.5 攪拌速度對(duì)酯化率的影響 在植物甾醇濃度5%，酶用量1%，反應(yīng)時(shí)間3h，反應(yīng)溫度100℃條件下，考察不同攪拌速度對(duì)甾醇酯酯化率的影響見圖5。由于攪拌一方面可以使葵花油分子、甾醇分子和酶之間的接觸面積增大，使酯交換反應(yīng)產(chǎn)物均勻;另一方面還可以使傳質(zhì)均勻，有利于酯交換反應(yīng)的進(jìn)行。由圖5可以看出，隨著攪拌速度的提高，酯化率明顯增加。但由于實(shí)驗(yàn)室條件所限，600 r/m in為最大攪拌速度。因此，選擇600 r/min為最佳攪拌速度。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化率的影響

圖5 不同攪拌速度對(duì)酯化率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，得出影響酯化反應(yīng)的主要因素，即反應(yīng)時(shí)間、甾醇濃度、酶用量、攪拌速度。選用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間為3h，確定最佳反應(yīng)條件，以得到酯化率較高的油脂制品。因素水平表見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

從表2中可以看出，A2B1C2D3為最佳條件，即:反應(yīng)溫度100℃、在植物甾醇濃度5%、酶用量1%、攪拌速度600r/min。各因素對(duì)甾醇酯化反應(yīng)的影響主次順序?yàn)?甾醇濃度>反應(yīng)溫度>酶用量>攪拌速度，按照得到的最佳條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，酯化率為89.7%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所介紹的方法，反應(yīng)過程中無對(duì)人體有毒有害化學(xué)試劑的使用，有效避免了試劑殘留對(duì)人體健康影響的問題，使甾醇制品更加安全、放心。植物甾醇酯制品可以很好地添加到食品、油脂中，不僅滿足人們的營(yíng)養(yǎng)需求，更具有保健功能。

通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)綜合分析，最終確定最佳反應(yīng)條件:植物甾醇濃度5%，酶用量1%，反應(yīng)時(shí)間3h，反應(yīng)溫度100℃，攪拌速度600r/min，酯化率為89.7%。

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Study on synthesis of phytosterol esters using enzymatic method

YU Dian－yu1，WANG Teng－yu2，CHEN Hao2，ZHU Xiu－qing2，JIANG Lian－zhou1，2，HU Li－zhi2，*
(1.Northeast Agricultural University Food College，Harbin 150030，China;2.Northeast Agricultural University，National Research Center of Soybean Engineering ＆ Technology，Harbin 150030，China)

Transesterification was conducted in sunflower oil with phytosterol by Novozym 435 lipase catalyzation.The optimum conditions were obtained by the single factor and orthogonal tests.Phytosterol concentration was 5%，the usage of lipase was 1%，the reaction time was 3h，the reaction temperature was 100℃，and the stirring speed was 600r/min.The esterification rate was 89.7%under the optimum conditions.

phytosterol;sunflower oil;transesterification;lipase

TS201.1

B

1002－0306(2011)06－0318－03

2010－06－01 *通訊聯(lián)系人

于殿宇(1964－)，男，教授，碩士，主要從事大豆油脂加工技術(shù)研究。

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(11551064);黑龍江省2009科技攻關(guān)項(xiàng)目(WB09B201－1)。