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        高效液相色譜法測定白芍藥材中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量

        2011-10-09 05:11:32李偉張建軍王衛(wèi)茜陳振振王景霞歐麗娜
        中藥與臨床 2011年6期
        關(guān)鍵詞:白芍芍藥內(nèi)酯

        李偉,張建軍,王衛(wèi)茜,陳振振,王景霞,歐麗娜

        白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根,味苦、酸,性微寒,歸肝、脾經(jīng),功能平肝止痛,養(yǎng)血調(diào)經(jīng),斂陰止汗。白芍中主要含有單萜及其苷類化合物,稱為白芍總苷(TGP),包含芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷(又名羥基芍藥苷)、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷、芍藥苷元酮和白芍苷R1等十余種成分[1~4]。目前,對芍藥苷的活性研究較多,白芍藥材及含白芍制劑的質(zhì)量控制多以芍藥苷為指標(biāo),采用高效液相色譜法測定,但對芍藥內(nèi)酯苷的研究較少,近年來對芍藥內(nèi)酯苷的活性和含量測定越來越引起重視[5~6]。為更好的控制白芍藥材質(zhì)量,指導(dǎo)其藥學(xué)、藥效毒理學(xué)研究,本研究建立了采用高效液相色譜法同時測定白芍藥材中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的方法。

        1 儀器與試劑

        Agilent1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司),Kromasil C18(4.6×250 mm,5 μm)色譜柱(瑞典EKA Chemicals公司),超聲波清洗器(功率250 W,頻率50 kHz)(濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司),甲醇(色譜純,Merck公司),水為超純水,磷酸、氫氧化鈉為分析純。芍藥苷對照品購自:中國藥品生物制品檢定所(供含量測定用,批號:110736-200732);芍藥內(nèi)酯苷對照品購自:wako日本和光純藥公司(批號:016-22201)。本研究收集市售白芍藥材樣品8批,由北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方藥系臨床中藥教研室張建軍副研究員鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactif l ora Pall.的干燥根。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 對照品溶液的制備

        精密稱取芍藥內(nèi)酯苷對照品和芍藥苷對照品適量,加甲醇制成每1 mL各含0.02 mg的溶液,即得。

        2.2 供試品溶液的制備

        取白芍藥材粉末約0.1 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,加入稀乙醇45 mL,超聲提取30分鐘,放冷,加稀乙醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.3 色譜條件

        以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以甲醇-0.1%磷酸溶液(用1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.2)(34∶66)為流動相,檢測波長為230 nm。進(jìn)樣量10 μL,理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。見圖1。

        2.4 檢測波長的確定

        經(jīng)紫外光譜掃描,確定檢測波長為芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的最大吸收波長230 nm。

        2.5 線性關(guān)系考察

        精密稱取芍藥內(nèi)酯苷對照品適量,加甲醇配制成每1 mL含芍藥內(nèi)酯苷0.0018 mg,0.0036 mg,0.0072 mg,0.0144 mg,0.0288 mg,0.0576 mg的溶液;精密稱取芍藥苷對照品適量,加甲醇配制成每1 mL含芍藥苷0.0028 mg,0.0056 mg,0.0112 mg,0.0224 mg,0.0448 mg,0.0896 mg的溶液。分別吸取各對照品溶液10 μL,注入高效液相色譜儀,依法測定峰面積,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,芍藥內(nèi)酯苷在0.018~0.576 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,其回歸方程為:Y=926.19X-0.9368,r=0.9999;芍藥苷在0.028~0.896 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,其回歸方程為:Y=1440X-0.3503,r=0.9999。

        2.6 對照品純度考察

        分別精密稱取芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品,用流動相溶解,制成每1 mL含量為2.58 mg和2.36 mg的對照品溶液,吸取20 μL注入高效液相色譜儀,按面積歸一化法測定純度。結(jié)果表明,芍藥內(nèi)酯苷對照品純度為98.51%,RSD為0.22%;芍藥苷對照品純度為98.61%,RSD為0.18%。

        2.7 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

        精密稱取芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定峰面積,計(jì)算RSD分別為1.2%,0.94%。

        2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

        取芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品溶液及供試品依法制備成供試品溶液,在0、24、48小時內(nèi)依法測定。結(jié)果表明,芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品溶液和供試品溶液在48小時內(nèi)穩(wěn)定,RSD分別為0.67%,0.95%;0.97%,0.61%。

        2.9 樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

        精密稱取同一批次白芍藥材6份,按上述方法測定芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷含量。測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷的平均含量分別為0.75%、3.13%,RSD分別為1.27%,1.32%,表明方法重復(fù)性良好。

        2.1 0 回收率實(shí)驗(yàn)

        精密稱取已知含量的同一批次白芍藥材0.05 g,按樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算芍藥內(nèi)酯苷含量為7.48 gkg-1,分別精密加入芍藥內(nèi)酯苷對照品0.358 mg,按供試品溶液制備方法及上述高效液相色譜條件操作,測定含量,計(jì)算回收率。結(jié)果表明,芍藥內(nèi)酯苷平均回收率98.18%,RSD%為1.78%。結(jié)果見表1。

        表1 芍藥內(nèi)酯苷回收率實(shí)驗(yàn)

        精密稱取已知含量的同一批次白芍藥材0.05 g,按樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算芍藥苷含量為31.30 gkg-1,分別精密加入芍藥苷對照品1.502 mg,按供試品溶液制備方法及上述高效液相色譜條件操作,測定含量,計(jì)算回收率。結(jié)果表明,芍藥苷平均回收率為98.26%,RSD%為1.25%。結(jié)果見表2。

        表2 芍藥苷回收率實(shí)驗(yàn)

        2.1 1 樣品含量測定結(jié)果

        從白芍藥材的主要產(chǎn)地(浙江、安徽、四川)收集多批次未經(jīng)硫磺熏制加工的白芍藥材樣品,按上述含量測定方法進(jìn)行含量測定。結(jié)果表明芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷含量分別不少于0.75%和2.71%,平均值分別為0.95%和2.93%。結(jié)果見表3。

        表3 白芍藥材含量測定結(jié)果

        3 討論

        3.1 氧化芍藥苷干擾芍藥內(nèi)酯苷含量測定

        參考以往文獻(xiàn)報(bào)道,采用下述3種流動相進(jìn)行高效液相色譜法檢測,方法①:采用中國藥典2010版一部白芍藥材芍藥苷含量測定項(xiàng)下流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(14:86);方法[7]②:采用甲醇-水(30:70)為流動相[8];方法③:采用中國藥典2010版一部赤芍藥材芍藥苷含量測定項(xiàng)下的流動相甲醇-0.05molL-1磷酸二氫鉀溶液(40:65)[9]。結(jié)果見圖2。方法①和②的色譜圖均為兩個峰,但芍藥內(nèi)酯苷加樣回收率不符合規(guī)定,說明可能該方法不能準(zhǔn)確測定芍藥內(nèi)酯苷;方法③色譜圖為三個峰,芍藥內(nèi)酯苷芍藥苷之間有一個色譜峰且和芍藥內(nèi)酯苷不能完全分離,調(diào)整流動相中有機(jī)相和水相的比例亦無法分離;同一樣品,在芍藥苷峰面積近似的情況下,方法③芍藥內(nèi)酯苷和該未知成分的色譜峰面積之和與方法①和②芍藥內(nèi)酯苷面積基本相等。結(jié)果表明在以上條件下,白芍藥材中含有對芍藥內(nèi)酯苷檢測有干擾的成分。經(jīng)與氧化芍藥苷對照品進(jìn)行對照,確定此干擾成分為氧化芍藥苷。

        3.2 采用甲醇與適宜pH的鹽溶液組成的流動相可以同時測定芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷

        對芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷是同分異構(gòu)體,但芍藥內(nèi)酯苷具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu),極性比芍藥苷大;氧化芍藥苷比芍藥苷多一個酚羥基,極性也比芍藥苷大。而氧化芍藥苷色譜行為易受pH影響,可利用酸堿性使其與芍藥內(nèi)酯苷分離。

        流動相采用甲醇-不同pH的磷酸-磷酸鹽溶液,配制含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的對照品溶液,以3個色譜峰的分離度為指標(biāo),對流動相的pH進(jìn)行考察。結(jié)果見圖3。結(jié)果表明,改變流動相pH,芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的分離度沒有明顯改變,而氧化芍藥苷隨流動相pH升高,保留時間縮短;反之,pH降低,保留時間延長。確定選用pH為4.2的流動相,可使3個色譜峰完全分離,并可節(jié)省檢測時間。

        芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷均為白芍中含量相對較高的單萜類成分,目前2010年版《中國藥典》只規(guī)定了白芍藥材和飲片中的芍藥苷的含量,未規(guī)定芍藥內(nèi)酯苷的含量。本研究為確定白芍藥材中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量提供了方法,對于白芍藥材、飲片或制劑生產(chǎn)的質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義。

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