秦春霞，錢海，車力龍，秦從軍，陳謙，肖德生

(1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.廣州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與全科醫(yī)學(xué)學(xué)院，廣東廣州510182)

一氧化氮在有氧運動大鼠股四頭肌過氧化應(yīng)激及JNK表達中的作用

秦春霞1，錢海1，車力龍1，秦從軍1，陳謙1，肖德生2

(1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.廣州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與全科醫(yī)學(xué)學(xué)院，廣東廣州510182)

目的:探討有氧運動后一氧化氮(NO)對股四頭肌的過氧化應(yīng)激及MAPK通路的調(diào)控作用。方法:大鼠分為靜息組(SED)、運動組(EXE)、靜息+NOS抑制組(SED－LNAME)、運動+NOS抑制組(EXE－LNAME)。運動組及運動+NOS抑制組每周連續(xù)游泳5d。共持續(xù)3個月。觀察大鼠股四頭肌MDA、SOD、TAOC及JNK水平的變化。結(jié)果:與SED組比較，EXE組大鼠股四頭肌SOD、TAOC、p－JNK蛋白顯著升高，在應(yīng)用L－NAME干預(yù)后，運動+NOS抑制組MDA升高，SOD、TAOC、p－JNK顯著下降，t－JNK無顯著性變化。結(jié)論:運動訓(xùn)練誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO可能介導(dǎo)JNK信號激酶誘導(dǎo)抗氧化酶產(chǎn)生，從而提高骨骼肌的抗氧化能力。

運動;抗氧化;NO;JNK

有氧運動時肌組織血流量和氧消耗增多，自由基生成增多，引起過氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時骨骼肌抗氧化機制增強，從而對肌肉發(fā)揮保護作用。NO以多種形式保護細胞免受過氧化損傷，包括與多種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物以近擴散速率進行反應(yīng)，阻止脂質(zhì)過氧化鏈，甚至抑制細胞凋亡［1］。運動期間NO還能激活NF－κB DNA結(jié)合物，促進Mn－SOD，iNOS和eNOS的表達［2］。運動可通過激活大鼠骨骼肌細胞MAPK通路(ERK1/2、JNK、P38)，參與過氧化應(yīng)激機制［3，4］，其中運動后股四頭肌NO水平升高，是否通過JNK通路調(diào)控對氧化應(yīng)激發(fā)揮調(diào)節(jié)作用?本研究對此加以探討。

1 研究方法

1.1 實驗動物與分組

雌性SD大鼠40只，由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于帶不銹鋼底的標準大鼠籠內(nèi)，室溫(23±1)℃，相對濕度(50±5)%，12h/12h光－暗節(jié)律。40只大鼠隨機分為靜息組(SED)、運動組(EXE)、靜息+NOS抑制組(SEDLNAME)、運動+NOS抑制組(EXE－LNAME)，每組10只。靜息+NOS抑制組和運動+NOS抑制組均以灌胃的方式給予一氧化氮合酶拮抗劑(L－NG－nitro－arginine methyl ester，LNAME，1mg/ml)的蒸餾水。大鼠飼料為AIN－93標準飼料，由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。

1.2 運動方法

運動組和運動+NOS抑制組大鼠在80cm×50cm×80cm的玻璃水缸中游泳，水深50cm，水溫(34±1)℃。每周連續(xù)游泳5d，休息1d，1次/d。每次游泳持續(xù)時間為第1周30min，第2周1h，第3周開始固定為2h，共持續(xù)3個月。靜息組和靜息+NOS抑制組除運動以外，其余處理與相應(yīng)的運動組相同。

1.3 動物處理

大鼠在禁食12～24h后，用乙醚麻醉斷頭放血。迅速取其股四頭肌，液氮速凍，存放于－70℃待測。

1.4 分析方法

采用BCA法測蛋白含量，硫代巴比妥酸TBA比色法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化岐化酶SOD活力，比色法測定總抗氧化能力T－AOC，硝酸還原酶法測定NO，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，蛋白免疫印跡法測定JNK水平，實驗操作嚴格按說明書進行。

1.5 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件進行雙因素方差分析和組間比較。

2 結(jié)果

2.1 NO含量的變化

如圖1所示，與靜息組相比，運動組NO含量顯著升高(P＜0.01)，表明運動可升高股四頭肌內(nèi)NO含量;靜息+NOS抑制組NO含量無顯著性差異。表明了內(nèi)源性NOS的活性受到抑制。運動+NOS抑制組NO含量低于運動組(P＜0.05)，表明一氧化氮酶抑制劑在運動期間抑制了運動誘導(dǎo)的股四頭肌NOS活性的升高。

圖1 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌NO含量的影響注:a表示P＜0.01vs SED;b表示P＜0.05vs EXE，下同。

2.2 MDA水平的變化

如圖2所示，與靜息組相比，運動組MDA水平有降低趨勢但無顯著性差異(P＞0.05)。運動組+NOS抑制組MDA水平高于運動組(P＜0.05)，表明運動期間一氧化氮合酶抑制劑干預(yù)后，股四頭肌脂質(zhì)過氧化水平升高。

2.3 SOD水平的變化

如圖3所示，與靜息組比較，運動組SOD含量升高(P＜0.05)，表明運動可升高股四頭肌SOD含量;靜息+NOS抑制組無顯著性差異。運動+NOS抑制組SOD水平低于運動組(P＜0.05)，表明在運動期間一氧化氮合酶抑制劑干預(yù)后，股四頭肌SOD含量降低。

2.4 TAOC水平的變化

如圖4所示，與靜息組比較，運動組TAOC水平顯著升高(P＜0.01)，表明運動后股四頭肌TAOC含量升高;靜息+NOS抑制組差異無顯著性意義;運動+NOS抑制組低于運動組(P＜0.05)，表明在運動期間一氧化氮合酶抑制劑干預(yù)后，股四頭肌TAOC水平下降。

圖2 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌MDA含量的影響

圖3 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌SOD含量的影響

圖4 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌TAOC水平的影響

2.5 p－JNK表達的變化

如圖5所示，與靜息組比較，運動組JNK水平顯著升高(P＜0.01)，表明運動可升高股四頭肌JNK蛋白表達水平;應(yīng)用L－NAME干預(yù)后，靜息+NOS抑制組差異無顯著意義，運動+NOS抑制組顯著降低(P＜0.01)，表明在運動期間給予一氧化氮合酶抑制劑干預(yù)后，股四頭肌P－JNK蛋白表達水平降低。

2.6 t－JNK表達的變化

如圖6所示，與靜息組比較，運動組t－JNK蛋白表達水平無顯著差異。應(yīng)用L－NAME干預(yù)后，靜息+NOS抑制組和運動+NOS抑制組沒有顯著性變化，表明運動訓(xùn)練及LNAME對大鼠股四頭肌t－JNK蛋白表達水平無影響。

圖5 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌p－JNK水平的影響

圖6 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌t－JNK水平的影響注:1:SED;2:EXE;3:SED－LNAME;4:EXE－LNAME

3 討論

早期研究已證明游泳三個月后大鼠腓腸肌GSH含量顯著降低，MDA無顯著變化［5］。大量研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動提高機體清除自由基的能力和降低骨骼肌自由基［6］。有氧運動增加血清和腓腸肌TAOC，減小脂質(zhì)過氧化水平［7，8］。本研究結(jié)果說明，運動訓(xùn)練后大鼠股四頭肌SOD、TAOC升高，MDA沒有顯著性改變，表明自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，抗氧化酶活性增強，機體的抗氧化能力提高，骨骼肌對運動產(chǎn)生了適應(yīng)性。股四頭肌與報道中的腓腸肌的抗氧化差別可能包括運動對象、運動時間、運動強度、機制的不同。

NO與體內(nèi)的氧、超氧陰離子、血紅蛋白等發(fā)生氧化反應(yīng)形成穩(wěn)定的硝酸鹽或亞硝酸鹽，以多種方式保護細胞免受過氧化損傷。NO與多種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物以近擴散速率進行反應(yīng)，阻止脂質(zhì)過氧化鏈，甚至抑制細胞凋亡［1］。同時NO還促進線粒體的增多和增大［9］，長期有氧運動訓(xùn)練使線粒體產(chǎn)生適應(yīng)性變化，線粒體數(shù)目增多、酶合成增加、活性提高。研究表明，運動中產(chǎn)生的RON能激活NF－κB DNA結(jié)合物，促使腓腸肌中Mn－SOD，iNOS和eNOS的表達［2］。本研究觀察到，運動后股四頭肌氧化指標無顯著性變化，抗氧化能力提高，同時p－JNK表達升高，但是在NOS表達受抑制時，使NO產(chǎn)生減少，氧化損傷增加，抗氧化能力減弱，p－JNK表達降低。說明運動后誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO水平影響了抗氧化酶的活性，同時NO可能介導(dǎo)了JNK的磷酸化過程。因此，可以認為運動產(chǎn)生的NO分子可能通過增加JNK磷酸化表達，上調(diào)抗氧化酶基因表達和調(diào)節(jié)參與運動訓(xùn)練的蛋白表達，從而使機體對運動訓(xùn)練產(chǎn)生生理適應(yīng)性。

運動激活JNK活性，并促進c－Jun的表達與磷酸化［10］。運動形式、運動對象、運動強度不同，JNK活性程度也不同。江鐘立等研究顯示急性等張運動可以使股四頭肌的JNK活性升高4．1倍，而三周運動訓(xùn)練使JNK活性更高。提示運動對肌肉蛋白代謝的調(diào)節(jié)機制與JNK激活的活性有關(guān)［11］。人及大鼠的股外側(cè)肌急性運動后，JNK活性顯著升高并且上調(diào)了c－Jun mRNA的表達，且認為運動誘導(dǎo)的JNK信號激活是肌肉收縮的內(nèi)在反應(yīng)，急性運動訓(xùn)練表現(xiàn)為骨骼肌蛋白降解的一過性增多，而運動訓(xùn)練反應(yīng)表現(xiàn)為蛋白合成的增加和基因表達的改變［10］。

運動產(chǎn)生的多種抗氧化蛋白與JNK通路相關(guān)。運動訓(xùn)練提高了HO－1水平，同時HO－1還可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鐵貯存和增加鐵排出，進而阻止游離鐵通過Harber－weiss反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基而造成組織損傷［12］。JNK參與了HO－1的信號通路，保護內(nèi)皮細胞免受損傷［13］。研究表明HSP72在骨骼肌表達是骨骼肌自身的內(nèi)源性保護機制［14］，HSP72可誘導(dǎo)SOD活性增加，對保護細胞免受自由基損傷起重要的作用［15，16，17］。運動能夠誘導(dǎo)骨骼肌表達IL－6［18，19］，在肌肉收縮時IL－6通過上游NF－κB和JNK被激活［20，21］。最新研究發(fā)現(xiàn)，運動肌肉中產(chǎn)生的NO增加了IL－6，IL－8，HO－1，HSP72蛋白的表達，并且在應(yīng)用L－NAME干預(yù)后都發(fā)生了逆轉(zhuǎn)［22］。說明NO參與調(diào)控了骨骼肌中抗氧化相關(guān)蛋白的表達。JNK信號通路誘導(dǎo)抗氧化酶的研究未見報道，本研究證明，NO可以對抗運動對骨骼肌脂質(zhì)過氧化損傷，JNK信號通路可能參與抗氧化酶的產(chǎn)生，但是JNK與NO介導(dǎo)的信號通路之間的關(guān)系需要進一步研究。

綜上所述，運動骨骼肌中NO生成增多，而NO直接或者間接的與細胞因子作用對抗機體脂質(zhì)過氧化損傷，并且可能調(diào)控骨骼肌JNK信號通路，誘導(dǎo)骨骼肌抗氧化蛋白及酶的表達。使其適應(yīng)運動所產(chǎn)生的各種生理變化，而對于NO對骨骼肌運動適應(yīng)性精確的信號調(diào)節(jié)機制仍需要進一步研究。

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責(zé)任編輯:喬艷春

Role of Nitric Oxide in Oxidative Stress and JNK Expression of Quadriceps Femoris of Rats in Aerobic Exercise

QIN Chunxia1，QIAN Hai1，CHE Lilong1，QIN Congjun1，CHEN Qian1，XIAO Desheng2
(1.School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China;2.School of Public Health and General Practice，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China)

Objective:To investigate the role of NO(nitric oxide)in oxidative stress and the MAPK pathways of quadriceps femoris in long-term aerobic exercise．Methods:Rats were divided into a sedentary group(SED)，an exercise group(EXE)，a sedentary plus L-NAME group(SED-LNAME)and an exercise plus L-NAME group(EXE-LNAME)．The rats in the EXE group and EXE plus LANME group swam for 5 days in a week，lasting for 3 months，and then the levels of MDA(malonaldehyde)，SOD(Superoxide Dismutase)，TAOC(total antioxidant capacity)and JNK(c-Jun N-terminal kinase)in the quadriceps femoris were analyzed．Results:Compared with the sedentary group，the contents of SOD，TAOC and p-JNK(phosphorylation-JNK)of the exercise group were significantly increased in quadriceps femoris．Treatment with L-NAME led to an increase in the MDA content，a significant decrease in the SOD，TAOC and p-JNK levels，without significant changes of the level of t-JNK in the EXE-LNAME group．Conclusion:During long-term aerobic exercise，NO may improve antioxidant capacity in skeletal muscle by increasing antioxidant enzymes activities，possibly through activating the JNK pathway．

exercise;antioxidant;NO;JNK

G804．23

A

1004－0560(2011)01－0058－04

2010-12-20;

2011-01-05

國家自然科學(xué)基金項目(30570894，30270639)。

秦春霞(1986－)，女，碩士研究生，主要研究方向為營養(yǎng)學(xué)及運動生理學(xué)調(diào)控機制。

肖德生(1961－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為營養(yǎng)學(xué)。