鞠大鵬，何晶晶，鄭雪莉，趙麗麗，楊公社

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100

雌激素受體關(guān)聯(lián)受體α調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞甘油三酯分解

鞠大鵬，何晶晶，鄭雪莉，趙麗麗，楊公社

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100

雌激素受體關(guān)聯(lián)受體α (Estrogen-related receptor α，ERRα) 是調(diào)控機(jī)體能量代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，也是脂肪生成的關(guān)鍵調(diào)控者。為研究ERRα對(duì)脂肪細(xì)胞甘油三酯分解的影響及其分子機(jī)制，分化的豬脂肪細(xì)胞在PKA (Protein kinase A) 或/和ERK (Extracellular signal-related kinase) 抑制劑預(yù)處理和不處理的情況下，再用Ad-ERRα侵染或XCT790處理48 h。通過測(cè)定脂肪細(xì)胞中甘油三酯濃度和培養(yǎng)液中的甘油釋放量分析脂肪細(xì)胞的脂解變化；Western blotting方法檢測(cè) PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、perilipin A、p-perilipin A、HSL (Hormone sensitive lipase，HSL) 和ATGL (Adipose triglyceride lipase，ATGL) 蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，ERRα顯著促進(jìn)豬脂肪細(xì)胞分化及甘油三酯積累，同時(shí)促進(jìn)了甘油三酯水解；分別及同時(shí)阻斷PKA和ERK通路并不影響ERRα對(duì)脂肪細(xì)胞甘油釋放的促進(jìn)作用；ERRα顯著上調(diào)HSL、ATGL、PPARγ及perilipin A蛋白表達(dá)，但p-perilipin A水平并未發(fā)生變化。推測(cè)過量表達(dá) ERRα可能導(dǎo)致 HSL和 ATGL蛋白表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)甘油三酯水解，從而為脂肪細(xì)胞分化提供更多的游離脂肪酸(Free fat acid，F(xiàn)FA) 作為甘油三酯合成周轉(zhuǎn)的底物。

豬，ERRα，甘油三酯水解，脂肪細(xì)胞

Abstract:Estrogen-related receptor α (ERRα) is a key regulator for energy metabolism and adipogenesis. However, its role in lipolysis is unknown. To study the function of ERRα in lipolysis, primary cultured differentiated porcine adipocytes were treated by a specific inverse agonist XCT790 or infected with adenoviral vector expressed ERRα for 48 h, in the absence and/or presence of specific protein kinase A (PKA) inhibitor or extracellular signal-related kinase (ERK) inhibitor. Then, we measured the triglyceride (TG) content and the glycerol release into the culture media to analysis the effect of ERRα on lipolysis; Further, we analyzed the expression of PPARγ, perilipin A, p-perilipin A, HSL and ATGL with Western blotting. Here, we found that ERRα significantly increased adipocytes differentiation, TG accumulation and glycerol release. Separately or simultaneously block the PKA and ERK pathway do not significantly altered the effect of ERRα on glycerol release. ERRα significantly up-regulated the proteins expression of PPARγ, perilipin A, HSL and ATGL, while the p-perilipin A protein level was not significantly changed.These findings imply that ERRα could increase lipolysis via up-regulating HSL and ATGL, thereby to supply more FFA as substrate for a larger turnover of cellular triglyceride pool during adipocytes differentiation.

Keywords:pig, estrogen-related receptor α (ERRα), lipolysis, adipocytes

雌激素受體關(guān)聯(lián)受體 α (Estrogen-related Receptor α，ERRα) 是最早被鑒定出的核激素受體之一[1]。大量研究表明，ERRα高表達(dá)于線粒體含量豐富的組織中，具有促進(jìn)線粒體生成及調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的作用[2-3]，此外，最近有研究者發(fā)現(xiàn)ERRα很可能在調(diào)控脂肪細(xì)胞甘油三酯積累過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。與此結(jié)果相一致的是，我們?cè)谇捌诘难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)抑制 ERRα蛋白表達(dá)能夠減少脂肪細(xì)胞中甘油三酯積累[6]，然而這種結(jié)果與脂肪細(xì)胞分化及甘油三酯水解的關(guān)系尚不清楚。與嚙齒類動(dòng)物相比，豬的體脂沉積較多，且在生理特性方面與人類有諸多相似之處，是研究人類肥胖及代謝相關(guān)疾病的重要醫(yī)學(xué)模型[7]。

本研究利用攜帶 ERRα基因的腺病毒及 ERRα特異性抑制劑 XCT790[8]處理原代培養(yǎng)的分化的豬脂肪細(xì)胞，探討 ERRα對(duì)豬脂肪細(xì)胞脂解的作用及其分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究 ERRα對(duì)脂肪細(xì)胞脂代謝的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：1~3日齡健康長(zhǎng)白仔豬由西北農(nóng)林科技大學(xué)種豬場(chǎng)提供，體重 1.5~2.5 kg，取樣前用0.5%的新潔爾滅清洗0.5 h，電擊處死。

實(shí)驗(yàn)材料：HEK293細(xì)胞系購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。BJ5183菌株、穿梭質(zhì)pAdTrack-CMV和腺病毒基因組質(zhì)粒 pAdeasy-1均為西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Taq酶和限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、PacⅠ、XbaⅠ、Hind Ⅲ、CIAP (Alkaline Phosphatase，CIAP) 均購于NEB公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、ultra-Pfu高保真Taq 酶購于Bioflux公司，普通Taq DNA聚合酶購于 Fermentas公司，質(zhì)粒大提試劑盒購于Omega公司，DMEM/F12、Ⅰ型膠原酶購于 Gibco公司，無酚紅的DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自 Invitrogen公司，ERRα特異性抑制劑XCT790購于Sigma公司，PKA通路抑制劑 H89、ERK通路抑制劑 PD98059、ERRα一抗 (Anti-goat)、perilipin A 一抗 (Anti-goat)、β-actin一抗 (Anti-mouse)、PPARγ一抗 (Anti-goat) 購于Santa Cruz公司，磷酸化PKA底物一抗 (Anti-rabbit，用于檢測(cè) p-perilipin A) HSL一抗 (Aiti-rabbit) 和ATGL一抗 (Anti-rabbit) 購于CST公司，甘油及甘油三酯檢測(cè)試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 ERRα腺病毒超表達(dá)載體的構(gòu)建、病毒包裝及滴度測(cè)定

1.3.1 帶酶切位點(diǎn)豬ERRα基因全長(zhǎng)開放閱讀框(Open reading frame，ORF) 序列獲得

豬ERRα基因全長(zhǎng)ORF序列由本實(shí)驗(yàn)室克隆獲得[6]。在此引物基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)上游帶Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)和下游帶 XbaⅠ的引物 (表 1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以獲得的豬 ERRα基因全長(zhǎng) ORF序列為模板，按照 ultra-Pfu高保真 Taq酶說明書進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 6 min; 94 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 105 s，30個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min; 4 ℃ 30 min。

表1 Touch down PCR引物Table 1 PCR primer

1.3.2 ERRα重組腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物和CMV空載體分別用XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后用DNA回收試劑盒回收，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物氯化鈣法轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于含100 μg/mL卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，適時(shí)挑取單克隆搖菌，按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書小量提取質(zhì)粒，經(jīng)XbaⅠ、Hind Ⅲ雙酶切和 PCR鑒定后，將獲得的陽性克隆質(zhì)粒 (即pAdTrack-ERRα) 送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。獲得pAdTrack-ERRα的質(zhì)粒DNA經(jīng)過PmeⅠ線性化和CIAP去磷酸化，轉(zhuǎn)化已轉(zhuǎn)入pAdEasy-1的感受態(tài)BJ5183菌發(fā)生同源重組。重組質(zhì)粒經(jīng)過PacⅠ酶切和 PCR鑒定后，將正確的重組質(zhì)粒命名為Ad-ERRα。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)菌擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)去內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒備用。

1.3.3 病毒包裝及滴度測(cè)定

將Ad-ERRα質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌中擴(kuò)大培養(yǎng)，去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒后，PacⅠ酶切線性化 Ad-ERRα并利用乙醇沉淀收集質(zhì)粒。LipofectaminTM2000攜帶線性化的 Ad-ERRα轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝，觀察細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因 GFP(Green fluorescent protein，GFP) 的表達(dá)及細(xì)胞的病變效應(yīng) (Cytopathic effect，CPE) 情況，并于轉(zhuǎn)染后第5天發(fā)生完全病變時(shí)收集上清作為病毒原液。隨后利用病毒原液反復(fù)感染HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增病毒。當(dāng)擴(kuò)增至10個(gè)T25-Flask時(shí)，于病毒侵染24 h內(nèi)收集細(xì)胞并懸浮2 mL PBS中，液氮和37 ℃水浴反復(fù)凍融5次后，12 000 r/min離心10 min收集病毒上清并于?80 ℃保存待用。

采用重復(fù)性較高的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue-culture infectious dose 50，TCID50) 法測(cè)定重組腺病毒Ad-ERRα的滴度并根據(jù)Karbers公式計(jì)算病毒滴度。滴度 T=10×101+d(s?0.5)TCID50/mL。其中d=lg稀釋度=1 (對(duì)于10倍的稀釋度而言)；s=陽性比率之和(從第一個(gè)10倍比稀釋度算起)。并根據(jù)以下公式，換算成PFU/mL，單位：T=1×10xTCID50/mL=1×10x–0.7PFU/mL。

1.4 原代豬脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

無菌條件下采集仔豬頸背部皮下脂肪組織，用Ⅰ型膠原酶消化法分離豬前體脂肪細(xì)胞[9]，以5×104細(xì)胞/cm2的密度接種于直徑 60 mm 的培養(yǎng)皿，加適量含 10%胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液，置于 37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種當(dāng)天記做第0天，以后每48 h更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合率至95%左右時(shí)更換為分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (胰島素5 μg/mL) 誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞分化，直至80%以上的前體脂肪細(xì)胞充脂分化并形成具有明顯的大脂滴后進(jìn)行處理，用于研究 ERRα在脂肪細(xì)胞脂解中的作用。

1.5 甘油含量測(cè)定

用甘油檢測(cè)試劑盒測(cè)定脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中的甘油濃度作為脂解率指標(biāo)，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。測(cè)量結(jié)果經(jīng)各組總蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化后，以空對(duì)照組甘油釋放量的倍數(shù)表示。

1.6 Western blotting檢測(cè)ERRα、HSL、ATGL、PPARγ、perilipin A和p-perilipin A蛋白表達(dá)

細(xì)胞總蛋白提?。焊鶕?jù)本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[10]，提取細(xì)胞總蛋白。考馬斯亮藍(lán)法定量后，根據(jù)定量結(jié)果，利用上樣緩沖液將不同組織蛋白的濃度調(diào)成一致，100 ℃沸水中煮5 min后，70 ℃保存。

蛋白電泳：取蛋白樣品50 μg上樣，以80 V電壓在12% SDS-PAGE中分離約2 h后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。

蛋白免疫印跡及蛋白表達(dá)分析：5% BSA室溫封閉 2 h，一抗(ERRα、HSL、ATGL、PPARγ、perilipin A和磷酸化PKA底物均為1：300)室溫孵育2 h，二抗 (羊二抗均為1∶3 000，鼠二抗和兔二抗均為1∶4 000) 室溫孵育2 h，ECL發(fā)光并利用Bio-Rad公司的化學(xué)發(fā)光儀 ChemiDocXRS+檢測(cè)蛋白表達(dá)變化。曝光后，利用Quantity one軟件分別計(jì)算各條帶與β-actin條帶吸光度的比值，即各蛋白表達(dá)量以目的蛋白吸光值與β-actin的吸光值的比值表示。處理組各蛋白的相對(duì)表達(dá)量以對(duì)照組的倍數(shù)表示。

1.7 甘油三酯含量測(cè)定及油紅O染色

超聲波法裂解細(xì)胞，收集上清。參照甘油三酯檢測(cè)試劑盒說明書，測(cè)定脂肪細(xì)胞中甘油三酯含量，并利用蛋白濃度對(duì)其含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。油紅O染色參照實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[11]進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 豬pAdTrack-CMV-ERRα穿梭載體及重組腺病毒Ad-ERRα的鑒定

構(gòu)建的 pAdTrack-CMV-ERRα穿梭載體進(jìn)行Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切，得到大小為1 269 bp和9 220 bp 2個(gè)片段 (圖1A)，說明穿梭載體構(gòu)建成功。pAdTrack-CMV-ERRα經(jīng)測(cè)序鑒定后，PmeⅠ酶切線性化并與骨架載體 pAdEasy-1進(jìn)行重組。重組的腺病毒載體經(jīng) PacⅠ酶切后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出1條大片段 (約30 kb) 及1條小片段 (約3.0或4.5 kb)，則可確定為陽性克隆。本試驗(yàn)中重組腺病毒載體Ad-ERRα經(jīng)PacⅠ酶切后電泳，可觀察到1 條大的DNA片段 (約30 kb) 和1條較小的DNA片段 (4.5 kb) (圖1B)，表明是陽性克隆。

圖1 pAdTrack-ERRa和pAd-ERRα的鑒定Fig. 1 Identification of recombinant pAdTrack-ERRa and recombinant Ad-ERRa. (A) pAdTrack-ERRa was identified by restriction enzyme digestion (Xba I and Hind Ⅲ ). (B) pAd-ERRa was identified by restriction enzyme Pac I digestion. M:DNA marker.

2.2 重組腺病毒的包裝及滴度測(cè)定

經(jīng)PacⅠ酶切線性化的 Ad-ERRα轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞。Ad-ERRα轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞 24 h后 GFP開始表達(dá) (圖2A)。轉(zhuǎn)染后48 h GFP的表達(dá)急劇升高，熒光數(shù)量顯著增加 (圖2B)。轉(zhuǎn)染后72 h后，細(xì)胞腫脹、變圓、皺縮。同時(shí)，釋放到培養(yǎng)液上清中的腺病毒開始并感染周圍的細(xì)胞 (圖2C)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，整個(gè)視野熒光數(shù)會(huì)逐漸增多。轉(zhuǎn)染后96 h，95%以上的細(xì)胞出現(xiàn)了CPE變化。收集的重組腺病毒原液經(jīng)擴(kuò)增后 (圖 2D)，用 TCID50法測(cè)定病毒滴度，滴度達(dá)到了9×108PFU/mL。

2.3 豬脂肪細(xì)胞中ERRα蛋白表達(dá)的調(diào)控

為研究ERRα對(duì)脂肪細(xì)胞脂解及分化的影響，我們擬采用Ad-ERRα及其特異性抑制劑XCT790調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)量。Ad-ERRα (MOI=20) 侵染及10 μmol/L XCT790[6]處理分化的脂肪48 h后，收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Ad-ERRα顯著上調(diào)了ERRα蛋白1.7倍，而XCT790下調(diào) ERRα蛋白 0.5倍 (圖 3)。表明 Ad-ERRα(MOI=20) 及10 μmol/L XCT790能夠在脂肪細(xì)胞中有效地調(diào)控ERRα蛋白表達(dá)。

圖2 重組腺病毒Ad-ERRα的包裝和擴(kuò)繁Fig. 2 Ad-ERRα virus production and harvest. HEK293 cells were transfected with Ad-ERRα. GFP expression was recorded at 24 h (A), 48 h (B) and 72 h (C) post transfection. (D)Ad-ERRα virus infect HEK293 cells.

圖3 Ad-ERRα及XCT790在分化的豬脂肪細(xì)胞中調(diào)控ERRα蛋白表達(dá)Fig. 3 Regulations of ERRα protein expression in differentiated porcine adipocytes by Ad-ERRα virus and XCT790.Differentiated porcine adipocytes were infected with Ad-ERRα(or Ad-GFP) or treated with XCT790 (or DMSO) for 48 h.Whole cell protein were extracted and subjected to Western blotting with ERRα and β-actin antibodies. The relative expression level of ERRα protein among different treatment was analyzed. Different letters show significant differences(P<0.05).

2.4 ERRα促進(jìn)脂肪細(xì)胞甘油三酯積累及甘油釋放

實(shí)現(xiàn)在豬脂肪細(xì)胞中調(diào)節(jié)ERRα蛋白表達(dá)后，進(jìn)一步分析了其對(duì)脂肪細(xì)胞甘油三酯積累和甘油三酯水解的影響。與我們之前結(jié)果相一致，Ad-ERRα處理組細(xì)胞甘油三酯含量為其對(duì)照的1.5倍，而XCT790處理組的甘油三酯含量?jī)H為其對(duì)照組的 40% (圖4A)。進(jìn)一步甘油釋放量分析發(fā)現(xiàn)，Ad-ERRα處理組細(xì)胞甘油釋放量為其對(duì)照的1.2倍，而XCT790處理組的甘油釋放量為其對(duì)照組的 80% (圖 4B)。以上結(jié)果表明，盡管 ERRα促進(jìn)了脂肪細(xì)胞中甘油三酯積累，但同時(shí)增加了脂肪細(xì)胞中脂肪水解。

2.5 PKA通路及ERK通路不參與調(diào)控ERRα促進(jìn)的脂肪細(xì)胞甘油釋放

圖4 ERRα調(diào)控分化的脂肪細(xì)胞中甘油三酯積累及水解Fig. 4 ERRα Regulate TG accumulation and lipolysis in differentiated porcine adipocytes by Ad-ERRα virus and XCT790. Differentiated porcine adipocytes were treated as described in Fig.3. The culture medium was collected for glycerol release determination. Cells were collected for TG concentration measurement. Different letters show significant differences (P<0.05).

脂肪細(xì)胞甘油三酯水解不僅受脂解酶以及脂解阻礙蛋白perilipin A的調(diào)控，脂解通路也發(fā)揮著重要的作用。其中，PKA[12]通路和ERK[13]通路是目前研究最為清楚的兩條脂解通路。我們接下來分析了這兩條通路在 ERRα促進(jìn)的脂解中的作用。結(jié)果顯示，無論同時(shí)阻斷兩條通路或阻斷其中任意一條通路后，均不能影響 ERRα誘導(dǎo)的甘油三酯水解 (圖5)。由此表明 PKA通路及 ERK通路不參與調(diào)控ERRα促進(jìn)的脂肪細(xì)胞甘油釋放。

圖5 H89及PD98059不影響ERRα對(duì)脂解的促進(jìn)作用Fig. 5 H89 and PD98059 do not change the ERRα stimulated lipolysis. Differentiated porcine adipocytes were pretreated with H89 and PD98059 separately or simultaneously for 48 h. Then were cultured for another 48 h at the present or absent of Ad-ERRα. Cell culture medium was collected for glycerol determination. *P<0.05 compared with the group without Ad-ERRα infection.

2.6 ERRα調(diào)控HSL、ATGL、PPARγ及perilipin A蛋白表達(dá)

由于PKA及ERK通路并不參與調(diào)控ERRα介導(dǎo)的脂肪水解，因此對(duì)脂解裝置，如脂解酶和脂滴包被蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，Ad-ERRα顯著上調(diào)了分化標(biāo)志蛋白PPARγ和perilipin A的表達(dá) (圖 6)。表明 ERRα能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。同時(shí)，脂解酶 HSL和 ATGL表達(dá)量也顯著上調(diào)，而p-perilipin A表達(dá)量并未發(fā)生明顯變化 (圖6)。表明，過表達(dá) ERRα所導(dǎo)致的脂解增加，很可能是通過調(diào)控脂解酶的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

3 討論

圖6 ERRα調(diào)節(jié)HSL、ATGL、PPARγ及perilipin A蛋白表達(dá)Fig. 6 ERRα regulates the protein expression of HSL, ATGL,PPARγ and perilipin A. Differentiated porcine adipocytes were treated as described in Fig. 3. Whole cell protein were extracted and subjected to western blotting with HSL, ATGL, PPARγ,perilipin A, p-perilipin A and β-actin antibodies. The relative expression level of ERRα protein among different treatment was analyzed. Different letters show significant differences(P<0.05).

ERRα是機(jī)體能量代謝網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控因子。在高能量消耗組織中，ERRα能夠通過調(diào)控線粒體的生物合成、氧化磷酸化以及脂肪酸的 β-氧化途徑影響機(jī)體的能量平衡[2-3]，而其在脂肪組織中的作用一直被人們忽視。直到 ERRα基因敲除鼠模型的產(chǎn)生[14]，人們才認(rèn)識(shí)到ERRα在脂肪形成中具有重要作用，從而拉開了研究其在脂肪組織中生理作用的序幕。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) mERRα隨脂肪細(xì)胞分化表達(dá)量增加[4]，并且與甘油三酯積累量正相關(guān)[5]，但其在脂解中的作用及機(jī)制尚不清楚。在成功地利用腺病毒表達(dá)載體及其特異性抑制劑 XCT790實(shí)現(xiàn)對(duì)ERRα蛋白表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)上，我們探討了其在脂肪細(xì)胞甘油三酯水解中的作用及機(jī)制。

與我們先前的結(jié)果相互支持的是[6]，過表達(dá)ERRα能夠促進(jìn)了脂肪細(xì)胞中甘油三酯的積累。而在此過程中，對(duì)脂肪細(xì)胞分化具有決定性調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ表達(dá)受到了ERRα的調(diào)控，而起作用機(jī)制及其與脂肪細(xì)胞分化的關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。脂肪細(xì)胞中甘油三酯的含量是其合成和分解動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的結(jié)果，當(dāng)甘油三酯合成的速度大于脂解時(shí)便會(huì)產(chǎn)生甘油三酯的積累。而在脂肪細(xì)胞積累甘油三酯的過程中，脂解的變化可能存在2種方式。其一，脂解作用減弱，促進(jìn)甘油三酯積累。其二，為滿足甘油三酯合成所需要大量的 FFA，脂肪細(xì)胞除通過吸收培養(yǎng)基中的FFA以外，還通過分解自身合成的甘油三酯[15]。然而，這兩種作用是否發(fā)生在Ad-ERRα促進(jìn)的脂肪細(xì)胞分化中尚不清楚。

眾多文獻(xiàn)表明，ERRα在分化的脂肪細(xì)胞中很可能是抑制甘油三酯水解的。Luo等[14]和Kutoh等[16]發(fā) 現(xiàn) ，ERRα 能 夠 結(jié) 合 在 β3-AR (β3-adrenergic receptor，β3-AR) 基因啟動(dòng)子區(qū)域，而ERRα基因敲出鼠β3-AR基因表達(dá)上升1.7倍，暗示ERRα很可能通過下調(diào)β3-AR基因表達(dá)而抑制PKA通路的脂解活性。Perilipin A (Perilipin家族的主要成員)作為脂滴膜上保護(hù)蛋白[17]，是多條脂解通路的終末靶點(diǎn)[17-18]，對(duì)脂肪分解具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，ERRα能夠轉(zhuǎn)錄激活 perilipin A的啟動(dòng)子活性[19]，表明ERRα很可能能通過調(diào)節(jié)perilipin A的活性影響脂肪細(xì)胞甘油三酯水解。綜合考慮過表達(dá) ERRα促進(jìn)了脂肪細(xì)胞中甘油三酯的積累，推測(cè) ERRα很可能在脂肪細(xì)胞中抑制甘油三酯水解。然而，我們?cè)谶^表達(dá) ERRα后發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞的甘油釋放量是顯著增加的。為了解釋這種現(xiàn)象，我們首先分析了脂肪細(xì)胞中的主要脂解通路，即PKA和ERK通路在此過程中的作用。由于這兩條通路能夠獨(dú)立或協(xié)同影響脂解[20]，因此在分別或同時(shí)阻斷這兩條后，檢測(cè)了ERRα的脂解效應(yīng)。結(jié)果顯示，這兩條通路均不參與調(diào)控 ERRα介導(dǎo)的脂解作用；接下來，進(jìn)一步分析了perilipin A的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，Ad-ERRα顯著上調(diào)perilipin A的表達(dá)，而其磷酸化水平并未發(fā)生改變，表明perilipin A并不參與調(diào)控此升高的脂解過程；最后，對(duì)脂解酶的表達(dá)量進(jìn)行的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HSL和 ATGL的表達(dá)量受到顯著上調(diào)，表明ERRα介導(dǎo)的脂解作用是通過上調(diào)這兩種酯酶實(shí)現(xiàn)的。研究揭示，PPARγ能夠直接調(diào)控HSL[21]和ATGL[22]蛋白的表達(dá)。本研究中，Ad-ERRα顯著上調(diào)PPARγ、HSL和ATGL蛋白表達(dá)，由此推斷，PPARγ表達(dá)水平的升高直接導(dǎo)致了HSL和ATGL蛋白的表達(dá)水平的上升。

綜上所述，本研究首次探討了 ERRα對(duì)脂肪細(xì)胞甘油三酯水解的影響，初步揭示了 ERRα調(diào)控甘油三酯水解的分子機(jī)理。本研究將為有效調(diào)控動(dòng)物體脂沉積、防治人類脂代謝相關(guān)疾病提供新的靶點(diǎn)和理論參考。

REFERENCES

[1] Giguere V, Yang N, Segui P, et al. Identification of a new class of steroid hormone receptors. Nature, 1988,331(6151): 91?94.

[2] Sladek R, Bader JA, Giguère V. The orphan nuclear receptor estrogen-related receptor alpha is a transcriptional regulator of the human medium-chain acyl coenzyme A dehydrogenase gene. Mol Cell Biol, 1997, 17(9):5400?5409.

[3] Sarah H, Peter T. Adopting new orphans into the family of metabolic regulators. Mol Endocrinol, 2008, 22(8):1743?1753.

[4] Nobuhiro I, Kazuhiro I, Kuniko HI, et al. Estrogen-related receptor α modulates the expression of adipogenesisrelated genes during adipocyte differentiation. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 358(3): 813?818.

[5] Nie Y, Wong C. Suppressing the activity of ERRα in 3T3-L1 adipocytes reduces mitochondrial biogenesis but enhances glycolysis and basal glucose uptake. J Cell Mol Med, 2009, 13(9B): 3051?3060.

[6] Ju DP, He JJ, Zheng XL, et al. Cloning, expression of the porcine Estrogen-related receptor a gene and its effect on lipid accumulation in mature adipocytes. Chin J Biotech,2009, 25(11): 1627?1632.

鞠大鵬, 何晶晶, 鄭雪莉, 等. 豬雌激素受體關(guān)聯(lián)受體α基因的克隆、表達(dá)及其對(duì)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)聚集的影響.生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(11): 1627?1632.

[7] Yang GS, Zhang HW, Bai L, et al. Pig?a ideal studyanimal model of obesity and diabeties. Prog Nat Sci, 2008,18(5): 481?487.

楊公社, 張浩衛(wèi), 白亮, 等. 豬—研究肥胖和糖尿病的理想模式動(dòng)物. 自然科學(xué)進(jìn)展, 2008, 18(5): 481?487.

[8] Olivia L, Stephanie B, Nathalie K, et al. Potentiation of ICI182, 780 (Fulvestrant)-induced estrogen receptor-α degradation by the estrogen receptor-related receptor-α inverse agonist XCT790. J Biol Chem, 2007, 282(39):28328?28334.

[9] Lin YQ, Zhuang HL, Yang GS. Effects of RXRα gene silencing on the porcine adipocyte differentiation in vitro.Comp Biochem Phys D, 2007, 2(3): 207?214.

[10] Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning. 3rd ed.Beijing: Science Press, 2002.

薩姆布魯克J, 拉塞爾DW. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南. 3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2002.

[11] Bai L, Pang WJ, Yang YJ, et al. Effects of nicotinamide on proliferation and differentiation in primarily cultured porcine preadipocytes. Acta Zool Sin, 2007, 53(6):1063?1068.

白亮, 龐衛(wèi)軍, 楊燕軍, 等. 煙酰胺在原代培養(yǎng)的豬前體脂肪細(xì)胞增殖分化中的作用. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2007, 53(6):1063?1068.

[12] Holm C, Osterlund T, Laurell H, et al. Molecular mechanisms regulating hormone-sensive lipase as and lipolysis. Annu Rev Nutr, 2000, 20: 365?393.

[13] Johanna ML, Magnus F, Stefan R, et al. β3-and α1-Adrenergic ERK1/2 activation is Src- but not Gimediated in Brown Adipocytes. J Biol Chem, 2000,275(30): 22670?22677.

[14] Luo JM, Robert S, Giguere V, et al. Reduced fat mass in mice lacking orphan nuclear receptor estrogen-related receptor a. Mol Cell Biol, 2003, 23(22): 7947?7956.

[15] Yi G, Kimberly RC, Robert VF, et al. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci, 2008, 122(6): 749?752.

[16] Kutoh E, Ongenae N, Claeskens A, et al. A putative white adipose tissue specif i c nuclear orphan receptor that interacts with the cAMP-response element of the human β3-adrenergic receptor gene. Mol Cell Endocrinol, 2000,165: 85?95.

[17] Zhang HH, Souza SC, Muliro KV, et al. Lipase-selective functional domains of perilipin A differentially regulate constitutive and protein kinase A-stimulated lipolysis. J Biol Chem, 2003, 278: 51535?51542.

[18] Miyoshi H, Souza SC, Zhang HH, et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms.J Biol Chem, 2006, 281(23): 15837?15844.

[19] Akter, MH, Yamaguchi T, Hirose F, et al. Perilipin, a critical regulator of fat storage and breakdown, is a target gene of estrogen receptor-related receptor alpha. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 368(3): 563?568.

[20] Katrin F, Aleksandra H, Eric M. Cooperative activation of lipolysis by Protein Kinase A and Protein Kinase C pathways in 3T3-L1 Adipocytes. Endocrinology, 2004,145(11): 4940?4947.

[21] Tuo D, Song S, Li P, et al. Peroxisome proliferator activated receptor γ transcriptionally up-regulates hormone sensitive lipase via the involvement of specificity protein-1. Endocrinology, 2006, 147(2): 875?884.

[22] Erin EK, Michael S, Guan HP, et al. PPARγ regulates adipose triglyceride lipase in adipocytes in vitro and in vivo. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007, 293:E1736?E1745.

Role of estrogen-related receptor α in adipocyes lipolysis

Dapeng Ju, Jingjing He, Xueli Zheng, Lili Zhao, and Gongshe Yang
Laboratory of Animal Fat Deposition and Muscle Development, College of Animal Science and Technology, Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100, China

Received: March 18; Accepted: June 22, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30472158).

Corresponding author: Dexiu Zhao. Tel: +86-10-62836201; E-mail: zhaodx@ibcas.ac.cn國家自然科學(xué)基金 (No. 30472158) 資助。