朱曄涵，杜賢榮，陳華昕，謝宇鋒，盛偉華，楊吉成

1 蘇州大學附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，蘇州 215006

2 蘇州大學醫(yī)學部 細胞與分子生物學教研室，蘇州 215123

Ad-ING4-IL-24雙基因共表達對人肺腺癌化療的增敏效應

朱曄涵1，杜賢榮1，陳華昕1，謝宇鋒2，盛偉華2，楊吉成2

1 蘇州大學附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，蘇州 215006

2 蘇州大學醫(yī)學部 細胞與分子生物學教研室，蘇州 215123

研究ING4 (腫瘤生長抑制因子4) 和IL-24 (人白細胞介素24) 雙基因共表達腺病毒載體 (Ad-ING4-IL-24) 對肺腺癌的化療增敏效應及分子機制。將Ad-ING4-IL-24感染A549肺癌細胞及聯(lián)合順鉑 (DDP) 化療藥物作用，RT-PCR和Western blotting檢測ING4和IL-24基因在A549肺癌細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達，MTT法、流式細胞儀 (FCM) 和 Hoechst染色法檢測Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP (聯(lián)合組) 對A549肺癌細胞的生長抑制和凋亡效應。采用A549細胞株建立人肺腺癌裸鼠模型，然后瘤體局部注射干預用藥，動態(tài)測量腫瘤體積，并計算瘤重抑瘤率，免疫組化檢測ING4、IL-24、bax、bcl-2、VEGF等基因的表達。結(jié)果表明，Ad-ING4-IL-24感染A549肺癌細胞后可獲得成功轉(zhuǎn)錄和表達，體外聯(lián)合組能明顯抑制A549肺癌細胞生長和誘導細胞凋亡，呈現(xiàn)出典型細胞凋亡形態(tài)學變化。體內(nèi)聯(lián)合組同樣能顯著抑制腫瘤生長，瘤重抑瘤率達52.81%，免疫組化結(jié)果顯示聯(lián)合組能上調(diào)bax基因表達，同時下調(diào)bcl-2、VEGF等基因的表達。以上結(jié)果表明Ad-ING4-IL-24具有化療增敏的作用，該作用機制可能與促進腫瘤細胞凋亡和抑制血管形成有關。

ING4，IL-24，順鉑，肺腺癌，化療增敏

Abstract:To study the chemosensitivity and the mechanisms of recombinant adenovirus vector expressing ING4 and IL-24(Ad-ING4-IL-24) on lung adenocarcinoma in vitro and in vivo, the expression of ING4 and IL-24 in A549 cells was detected by RT-PCR and Western blotting. The growth inhibition, apoptosis rate and apoptosis body were measured by MTT, flow cytometry andHoechst staining respectively. For in vivo study, we first established the A549 tumor model by grafting A549 cells in athymic nude mice; and then injected Ad-ING4-IL-24 into the tumors. Two weeks after injection, we killed the mice, removed the tumors, weighted and calculated the ratios of tumor-suppression. We also detected the expressions of ING4, IL-24, bax, bcl-2, VEGF with immunohistochemistry. The results indicated that ING4 and IL-24 were proved successfully transcription and expression in A549 cells. More interestingly, the joint group inhibited the growth of A549 cells and induced apoptosis. The in vivo data showed that the joint group suppressed the tumor growth conspicuously through up-regulating the expression of bax, and down- regulating the expression of bcl-2, VEGF. The study proved that Ad-ING4-IL-24 significantly enhanced the chemosensitivity to anticancer drug DDP in lung adenocarcinoma, which may related with cell apoptosis and antiangiogenesis.

Keywords:ING4, IL-24, cisplatin (DDP), adenocarcinoma, chemosensitivity

近年來肺癌的總體發(fā)病率呈明顯上升趨勢，5年生存率仍為15%左右，無明顯提高，嚴重威脅著人類的健康。目前對不適合手術(shù)切除的病人，使用細胞毒性藥物的化學治療就成為大部分肺癌患者的首選治療方法[1]。盡管新的抗癌化療藥物不斷推出，但是化療對肺癌的治療效果仍無顯著提高，治療失敗的主要原因是肺癌細胞多藥耐藥性 (MDR) 的產(chǎn)生，為了克服肺癌細胞多藥耐藥性，尋求化療增敏劑以提高療效是較為有效的途徑，但不少化療增敏劑均因毒性太大或效果有限而遭淘汰，甘氨雙唑鈉(Sodium glyci –didazole，CM-Na) 是我國研制的新型硝基咪唑類乏氧細胞增敏劑。前期基礎與臨床研究證實：CM-Na能選擇性提高腫瘤內(nèi)乏氧細胞的放射敏感性，對食管癌、非小細胞肺癌 (Non-Small cell lung cancer, NSCLC) 等實體瘤放射增敏效果明顯。其也有一定的化療增敏作用，臨床數(shù)據(jù)仍在積累過程中，但尚不能證明合用該藥明顯優(yōu)于現(xiàn)有標準化療及化放療方法。因此，尋求高效低毒并能改善患者預后的化療增敏劑任重道遠。

目前，將血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF) 的單克隆抗體貝伐單抗 (Bevacizumab，Avastin) 與化療藥物聯(lián)合應用的生物化療手段，在晚期癌癥的治療中顯示出良好的療效。鑒于ING4[2]基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制因子，屬于生長抑制因子家族(Inhibitor of growth family，ING家族) 新成員，具有提高化療藥物敏感性的作用[3]，IL-24也具有抑制腫瘤細胞生長[4]和提高肺癌細胞化療敏感性的作用[5]，已有研究表明[6]構(gòu)建的 IL-24和 E1A雙基因共表達腺病毒載體，作用于肝癌細胞后產(chǎn)生了更為顯著的抑瘤作用，那么將IL-24和ING4兩基因聯(lián)合共表達能否對肺癌細胞起化療增敏的作用？我們在成功構(gòu)建 IL-24和 ING4雙基因聯(lián)合共表達載體(Ad-ING4-IL-24) 的基礎上，觀察了Ad-ING4-IL-24及與順鉑聯(lián)合作用于 A549細胞及裸鼠移植瘤的化療增敏效應的影響，并探討了其分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌細胞株A549、QBI-293A細胞及攜帶GFP(綠色熒光蛋白) 的腺病毒空載體Ad、Ad-ING4-IL-24由蘇州大學基礎醫(yī)學系細胞與分子生物學教研室提供；RPMI-1640、新生小牛血清購自杭州賽樂生物科技公司；RNA抽提試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶購自MBI；IL-24、ING4基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1；IL-24、ING4一抗購自美國abcam公司；二抗均購于碧云天生物技術(shù)研究所；四甲基偶氮唑藍 (MTT) 購自美國Sigma公司；Annexin-v-PE/7-AAD凋亡試劑盒購于 Southern Biothech公司；Hoechst 染色試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；順鉑 (DDP) 購自江蘇連云港豪森制藥有限公司；3~4周齡、體重18~20 g/只雄性BALB/C裸鼠購自中國科學院上海斯萊克實驗動物中心[許可證號：SCXK(滬)2007-0005]；bcl-2、bax、VEGF抗體購自晶美公司。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primer used in this study

1.2 方法

1.2.1 IL-24和ING4雙基因共表達腺病毒載體的構(gòu)建

在蘇州大學醫(yī)學部細胞與分子生物學教研室構(gòu)建的pAdTrack-IRES雙基因共表達空載體的基礎上，成功構(gòu)建了 IL-24和 ING4雙基因共表達腺病毒載體：首先在pAdTrack-CMV轉(zhuǎn)移載體Sal I、Not I酶切位點間插入IRES片段，構(gòu)建pAdTrack-CMV-IRES改造轉(zhuǎn)移空載體；然后在pAdTrack-CMV-IRES改造轉(zhuǎn)移空載體Xho I、Xba I酶切位點間插入IL-24片段；Bgl Ⅱ、Sal I酶切位點間插入ING4片段，分別構(gòu)建 pAdTrack-CMV-IRES-IL-24、pAdTrack-CMVING4-IRES單基因重組轉(zhuǎn)移載體；最后在pAdTrack-CMV-IRES-IL-24單基因重組轉(zhuǎn)移載體Bgl Ⅱ、Sal I酶切位點間插入 ING4片段，構(gòu)建 pAdTrack-CMVING4-IRES-IL-24雙基因轉(zhuǎn)移載體 (圖1)，具體操作由蘇州大學基礎醫(yī)學和生物科學學院細胞與分子生物學教研室謝宇鋒老師完成。

1.2.2 Ad、Ad-ING4-IL-24腺病毒的擴增與效價的測定

通過Ad、Ad-ING4-IL-24感染 QBI-293A細胞獲得重組病毒子擴增，具體操作步驟及效價測定按本科室常規(guī)方法進行[4]。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與分組

采用常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含 10%小牛血清的RPMI-1640。在37 ℃、飽和濕度、5% CO2溫箱中培養(yǎng)，每1~2天換液傳代。分別設以下5組：1) 陰性對照組 (PBS組)：0.1 mol/L PBS，2) 空載體對照組 (Ad組)：50 MOI Ad，3) 陽性對照組 (DDP組)：順鉑 DDP (終濃度為 25 μg/mL)，4) Ad-ING4-IL-24組：50 MOI Ad-ING4-IL-24，5) Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP (聯(lián)合組)：50 MOI Ad-ING4-IL-24+DDP (終濃度為 12.5 μg/mL)。

1.2.4 ING4、IL-24在A549細胞中表達的鑒定

按上述分組處理A549細胞后，于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察感染情況及細胞形態(tài)變化。

1000r/min離心收集上述各組細胞，PBS洗滌2~3次后，按總 RNA抽提試劑盒說明書操作提取RNA，用IL-24 (P3、P4) 和ING4 (P5、P6) 的引物進行RT-PCR。PCR的反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

同時收集上述各組細胞按 107細胞/mL比例加細胞裂解液 (含終濃度為1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑) 進行裂解，充分裂解后12 000 r/min離心 5 min，取總蛋白上清進行蛋白變性，然后進行12% SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h；先后用羊抗人ING4抗體、鼠抗人IL-24抗體和HRP標記的驢抗羊和羊抗鼠的二抗孵育PVDF膜，DAB顯色檢測目的蛋白。

圖1 ING4和IL-24雙基因共表達模式示意圖Fig. 1 Co-expression mode of ING4 and IL-24.

1.2.5 MTT法檢測Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP對A549細胞生長的影響

將指數(shù)生長期的A549細胞，按1×105/mL的細胞濃度，于 96孔培養(yǎng)板每孔加 100 μL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄上清，按1.2.3分組進行實驗，每組設 3個復孔，37 ℃、5% CO2條件下孵育，隨后分別于1 d、2 d、3 d、4 d時加入MTT 10 μg/mL (5 mg/mL)，繼續(xù)孵育 4 h后加入 10%SDS-HCl終止液 (100 μL/孔)，置于 37 ℃，至次日待甲臢結(jié)晶完全溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測OD570值，以OD570值為縱坐標，時間為橫坐標繪制生長曲線，并計算細胞生長抑制率。

生長抑制率= (對照組 OD570值?實驗組 OD570值) /對照組OD570值×100%。

1.2.6 Annexin-V-PE/7-AAD雙染FMC檢測Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP對A549細胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期的A549細胞，按1.2.3方法進行分組開展細胞凋亡的誘導實驗，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h后收集細胞，PBS清洗2次，用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細胞濃度至106~107個/mL，取100 μL細胞于流式管中，加10 μL Annexin-V-PE冰上混勻，避光 15 min。依次加入 380 μL 1×結(jié)合緩沖液和10 μL 7-AAD，上流式細胞儀檢測。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡 (LSCM) 觀察Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP對A549細胞的核形態(tài)學改變

在鋪有玻片的六孔板中按5×104個/孔接種A549細胞，24 h后按上述分組處理細胞，再培養(yǎng)48 h后收獲細胞懸液，用PBS洗2~3次，經(jīng)4%多聚甲醛固定，Hoechst33258染色30 min，甘油封片后，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡小體。

1.2.8 肺癌動物模型的建立

取對數(shù)生長期的 A549肺癌貼壁細胞，PBS洗滌，經(jīng)0.25%胰酶消化，PBS洗滌2次，2 000 r/min離心5 min收獲細胞，重懸于無血清的1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度達 4×107個/mL。取 30只 2~3周BALB/C雄性裸鼠，用安爾碘在其右前肢腋下消毒后皮下注射上述制備的A549肺癌細胞懸液100 μL(4×106個細胞/只)，在 SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。隔日觀察A549人肺癌細胞在裸鼠體內(nèi)的生長和成瘤情況。

1.2.9 實驗分組和抗腫瘤治療

皮下接種2周待腫瘤直徑長至約5 mm時，將其隨機分成5組，每組6只，各組均使用瘤體內(nèi)多點注射干預用藥，PBS組用0.1 mL PBS，Ad組、Ad-ING4-IL-24組分別用0.1 mL (109PFU/mL) Ad和 Ad-ING4-IL-24，DDP組按 4 mg/kg劑量注射DDP，聯(lián)合組注射 0.1 mL Ad-ING4-IL-24+DDP(2 mg/kg)，隔日1次，共6次。

1.2.10 檢測指標及方法

用藥前和用藥后第 5、10、15、20天用游標卡尺分別測量皮下移植腫瘤的長徑 (a)、短徑 (b)，按公式計算瘤體體積 (V=ab2/2)，繪制腫瘤體積-時間變化曲線。治療結(jié)束 1周后處死裸鼠，摘取瘤體并稱重，計算各組抑瘤率。抑瘤率 (%) = (對照組腫瘤平均瘤重?治療組腫瘤平均瘤重) /對照組腫瘤平均瘤重×100%。

1.2.11 免疫組化檢測瘤體中各種因子的表達

腫瘤組織標本用10%中性甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，用于進行免疫組化檢測。采用抗體免疫組化SP染色后，以細胞質(zhì)內(nèi)和 (或) 細胞膜出現(xiàn)散在或彌漫狀分布的棕黃色顆粒為陽性細胞，每張切片隨機計數(shù)5個400倍視野，以每個視野所含陽性細胞數(shù)的平均值評價 ING4、IL-24、bax、bcl-2、VEGF蛋白的表達情況，取同組所有切片平均數(shù)進行統(tǒng)計學處理。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理

聯(lián)合組的化療增敏效果判斷用金正均法 (計算q 值)，q 值= E (A+B) / (EA+EB?EA·EB)，式中 EA、EB分別為A、B單用之效應，分子E (A+B) 代表實測合并效應，分母是期望合并效應。當q值=1±0.15時，兩藥間被認為有相加作用，q值＞1.15時，兩藥間被認為有協(xié)同作用，當 q＜0.85時，兩藥間有拮抗作用。

應用 SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (±s) 表示，采用One-Way ANOVA分析，組間比較采用 LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ING4、IL-24表達的鑒定

經(jīng)多輪感染、擴增后，測定的病毒效價達109PFU/mL，用50 MOI劑量的病毒感染A549細胞，體外培養(yǎng) 72 h后 (圖2)，Ad-ING4-IL-24作用的A549細胞出現(xiàn)變圓、脫落、皺縮等病變，Ad作用的A549細胞雖有輕度變圓，但無脫落、皺縮等病變，PBS組細胞貼壁生長狀態(tài)良好，數(shù)量多，形態(tài)正常，DDP作用后的細胞圓縮脫落，細胞貼壁數(shù)量減少。RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，Ad- ING4-IL-24組和聯(lián)合組在620 bp位置可檢測到一條IL-24基因轉(zhuǎn)錄特異性條帶，在750 bp位置可檢測到一條 ING4基因轉(zhuǎn)錄特異性條帶，而 PBS、Ad和DDP對照組中未出現(xiàn)預期條帶 (圖3)。Western blotting結(jié)果顯示，Ad-ING4-IL-24組和聯(lián)合組在相應位置產(chǎn)生了與抗ING4抗體和抗IL-24抗體結(jié)合的特異性條帶，而PBS、Ad和DDP組則在相應位置未出現(xiàn)條帶 (圖 4)。結(jié)果表明腺病毒介導的外源性ING4、IL-24目的基因能在 A549細胞中成功進行mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。

圖2 Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP作用A549細胞的形態(tài)變化Fig. 2 Morphologic change of A549 cells transduced with Ad-ING4-IL-24 and combined with DDP. (A) Light microscope. (B)Fluorescence microscope.

圖3 RT-PCR鑒定ING4、IL-24在A549細胞中的表達Fig. 3 Identification of ING4 and IL-24 in A549 cells by RT-PCR. M: DNA marker; 1: PBS group; 2: Ad group; 3: DDP group; 4: Ad-ING4-IL-24 group; 5: Ad-ING4-IL-24+DDP group.

圖4 Western blotting鑒定ING4、IL-24在A549肺癌細胞中的表達Fig. 4 Expression of ING4 and IL-24 in A549 cells by Western blotting. 1: PBS group; 2: Ad group; 3: DDP group; 4:Ad-ING4-IL-24 group; 5: Ad-ING4-IL-24+DDP group.

2.2 MTT法檢測 Ad-ING4-IL-24聯(lián)合 DDP對A549細胞生長的抑制

MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，Ad-ING4-IL-24、DDP、聯(lián)合組對A549細胞的生長有明顯的抑制作用并呈時間依賴性 (圖5)，其中第4天的生長抑制率 (圖6) 分別為(56.94±2.14)%、(64.24±0.86)%和 (75.38±0.95)%，與細胞對照PBS組和Ad空載體腺病毒組比較呈顯著性差異 (P＜0.05)。聯(lián)合組的生長抑制作用明顯優(yōu)于 Ad-ING4-IL-24組和 DDP組 (P＜0.05)，呈現(xiàn)化療增敏的相加效應 (q值=0.89)，而PBS組和Ad組無顯著性差異 (P＞0.05)。

圖5 Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP對A549細胞生長抑制作用曲線圖Fig. 5 Growth inhibiting curve chart of A549 cells transduced with Ad-ING4-IL-24 and combined with DDP.

圖6 Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP對A549細胞的生長抑制率Fig. 6 Growth inhibiting ratio of A549 cells transduced with Ad-ING4-IL-24 and combined with DDP.

2.3 Annexin-V-PE/7-AAD雙染法 FMC檢測Ad-ING4-IL-24聯(lián)合 DDP對 A549細胞凋亡的影響

用 Annexin-V-PE/7-AAD雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡 (圖 7)。由圖可見 Ad-ING4-IL-24、DDP和聯(lián)合組均能誘導A549細胞凋亡，72 h早期平均凋亡 率 分 別 為 (30.67±2.69)% 、 (23.56±3.07)% 和(52.81±3.44)%，與 Ad空載體腺病毒組和細胞對照PBS組比較呈顯著性差異 (P＜0.05)，其中聯(lián)合組誘導 A549細胞凋亡的作用明顯優(yōu)于 Ad-ING4-IL-24組及 DDP組 (P＜0.05)，也呈現(xiàn)化療增敏的相加效應 (q 值=1.12)。

圖7 流式細胞術(shù)檢測A549細胞凋亡率Fig. 7 Apoptosis rate of A549 cells detected by flow cytometry.

2.4 Ad-ING4-IL-24及其聯(lián)合DDP誘導A549肺癌細胞凋亡的細胞核形態(tài)改變

用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡的核形態(tài)變化 (圖8)，由圖可見Ad-ING4-IL-24作用的A549細胞很多出現(xiàn)胞體固縮，核斷裂，形成大小不等的塊狀或顆粒狀的熒光碎片，即典型的凋亡小體，DDP組及Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP組的A549肺癌細胞核均出現(xiàn)深染、固縮，甚至斷裂，呈現(xiàn)明顯的細胞凋亡的核形態(tài)特征，而PBS、Ad空載體腺病毒處理的細胞核形態(tài)正常，未出現(xiàn)上述細胞凋亡的特征。

2.5 體內(nèi)對人肺癌裸鼠移植瘤的抗腫瘤效應

圖8 熒光顯微鏡觀察A549細胞凋亡小體的形態(tài)學觀察Fig. 8 Apoptotic body of A549 cells observed by LSCM.

圖9 Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP對肺癌移植瘤的抑瘤效應Fig. 9 Inhibitory effect of lung cancer treated with Ad-ING4-IL-24 and combined with DDP. (A) The pictures of lung cancer. (B)The curves of tumor volume of lung cancer after treatment. (C) The inhibitory rate of tumor weight after treatment.

裸鼠皮下接種A549人肺癌細胞后，2周左右直徑可達5 mm左右，成瘤率達100%。由圖9A和圖9B可見，Ad-ING4-IL-24、DDP和聯(lián)合組對 A549裸鼠人肺癌移植瘤均有不同程度的抑制作用，與Ad組和 PBS組比較呈顯著性差異 (P＜0.05)，聯(lián)合組對裸鼠人肺癌移植瘤的體內(nèi)抗腫瘤效應明顯優(yōu)于Ad-ING4-IL-24組及DDP組 (P＜0.05)。瘤重抑瘤率比較如圖 9C所示，聯(lián)合組的瘤重抑瘤率達(69.7±0.34)%，與 Ad-ING4-IL-24組 (56.58±0.3)%和DDP組 (46.47±4)%的抑瘤率相比具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，對肺癌移植瘤的生長具有化療增敏的相加作用 (q值=0.91)。而PBS組Ad組相比，無顯著性差異 (P＞0.05)。

2.6 各組病理切片結(jié)果

2.6.1 瘤體切片ING4、IL-24蛋白的表達

免疫組化檢測結(jié)果顯示：Ad-ING4-IL-24組、聯(lián)合組的ING4、IL-24陽性細胞數(shù)明顯高于PBS組和Ad組，并呈強陽性表達(圖10)。而PBS組、Ad組、DDP組為陰性或弱陽性表達。表明腺病毒介導的外源性ING4、IL-24目的基因能在肺癌移植瘤中獲成功表達，同時也說明A549肺癌細胞本身 ING4、IL-24基因表達能力很弱或發(fā)生了缺陷，這種缺陷也可能與肺癌的發(fā)生有關。

2.6.2 瘤體切片bax、bcl-2、VEGF基因表達的檢測結(jié)果

由圖11可見，Ad-ING4-IL-24組、DDP組、聯(lián)合組的bax陽性細胞數(shù)明顯高于PBS組和Ad組(P＜0.05)，bcl-2、VEGF陽性細胞數(shù)明顯低于 PBS組和Ad組 (P＜0.05)，而聯(lián)合組明顯優(yōu)于Ad-ING4-IL-24組及DDP組 (P＜0.05)，PBS組和Ad組比較無顯著性差異 (P＞0.05)。結(jié)果表明聯(lián)合組能通過誘導腫瘤細胞凋亡和抑制血管生長等途徑抑制裸鼠人肺癌移植瘤的生長。

3 討論

長期以來化療對晚期肺癌，尤其NSCLC療效并不理想，含鉑的聯(lián)合化療方案是肺癌化療的主要方案，其效率一般在20%~48%之間[7]。效果仍不甚理想，主要原因在于腫瘤細胞的耐藥性。因此，尋求高效低毒的化療增敏劑及與細胞毒藥物有協(xié)同抗腫瘤活性而少有毒副作用的藥物是提高化療有效率的主要研究方向之一。

2004年在Nature雜志上ING4基因正式被確定為一種重要的腫瘤生長抑制因子[8]。研究表明，ING4可通過多途徑發(fā)揮特異性抗腫瘤效應，靶向誘導腫瘤細胞凋亡，是一種潛在的新型抑癌基因，Zhang等[3]建立了幾個穩(wěn)定表達 ING4的肝癌細胞系(HepG-2)，發(fā)現(xiàn)ING4能明顯抑制HepG-2細胞生長，提高肝癌細胞對 DNA損傷試劑 (如鬼臼乙叉甙和阿霉素) 的化學敏感性。白細胞介素24(IL-24) 作為一種抑癌基因，起初是在人類黑色素瘤細胞[9]中誘生而獲得的。研究表明，IL-24不僅能特異抑制多種腫瘤細胞生長、抑制腫瘤血管形成[10]和靶向誘導腫瘤細胞凋亡，而且還能提高化療和放療對腫瘤的敏感性[11-13]。

本研究采用 MTT和 FCM 檢測結(jié)果表明，Ad-ING4-IL-24聯(lián)合DDP化療藥物可抑制A549肺癌細胞生長和誘導凋亡，明顯優(yōu)于 Ad-ING4-IL-24組及DDP組，體內(nèi)對肺癌裸鼠移植瘤的生長抑制作用和誘導凋亡作用也明顯優(yōu)于 Ad-ING4-IL-24組及DDP組，具有化療增敏的相加效應。MDR產(chǎn)生的機理較復雜，普遍認為腫瘤細胞凋亡抵抗是產(chǎn)生多藥耐藥性的主要機制之一。大多數(shù)腫瘤化療藥物是通過誘導腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用的。Bc1-2是凋亡抑制基因。有研究發(fā)現(xiàn) bc1-2的過度表達與瘤細胞中的耐藥基因的表達相關聯(lián)，并可通過抑制細胞凋亡而導致耐藥性的發(fā)生[14]。Bax是促進細胞凋亡的基因，bc1-2與bax在體內(nèi)是通過二聚體而發(fā)揮作用的，bax / bc1-2下降，抑制凋亡，bax / bc1-2升高，促進凋亡。本研究結(jié)果示聯(lián)合組的 bax蛋白表達明顯上調(diào)，而 bcl-2蛋白表達明顯下降，bax /bc1-2升高。因此，Ad-ING4-IL-24通過上調(diào)bax和下調(diào) bcl-2表達來誘導腫瘤細胞凋亡可能是Ad-ING4-IL-24化療增敏的重要機制之一。

圖10 免疫組化檢測瘤體中ING4、IL-24蛋白的表達Fig. 10 Expression of ING4 and IL-24 in lung cancer.

圖11 免疫組化法檢測瘤體中各種因子的表達變化Fig. 11 Expression change of cytokines in lung cancer.

近年來化療與抗血管生成藥的聯(lián)合應用也越來越多，抗血管生成療法已成為癌癥化療增敏的新策略[15]。貝伐單抗為血管內(nèi)皮細胞生長因子 (VEGF)的人源單抗。聯(lián)合貝伐單抗的化療方案在美國及許多其他國家已獲準作為結(jié)直腸癌的一線治療[16]。此聯(lián)合貝伐單抗治療方法在乳腺癌及非小細胞肺癌的Ⅲ期臨床試驗也同樣顯示了較為理想的結(jié)果。研究顯示聯(lián)合組的VEGF陽性細胞數(shù)明顯低于Ad-ING4-IL-24組與DDP組，提示Ad-ING4-IL-24抑制VEGF的表達從而抑制腫瘤血管生成，可能是Ad-ING4-IL-24化療增敏的又一途徑。

綜上所述，本研究結(jié)果表明 Ad-ING4-IL-24能提高人肺腺癌細胞及移植瘤對DDP的化療敏感性，即具有化療增敏作用。

REFERENCES

[1] Chu DT. The Evaluation of Current Therapeutic Regimens of Medical Oncology. Beijing: Peking University Medical Press, 2004: 289.

儲大同. 當代腫瘤內(nèi)科治療方案評價. 北京: 北京大學醫(yī)學出版社, 2004: 289.

[2] Kim S, Chin K, Gray JW, et al. A screen for genes that suppress loss of contact inhibition: identification of ING4 as a candidate tumor suppressor gene in human cancer.Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(46): 1625l?16256.

[3] Zhang X, Xu LS, Wang ZQ, et al. ING4 induces G2/M cell cycle arrest and enhances the chemosensitivity to DNA-damage agents in HepG2 cells. FEBS Lett, 2004,570(1/3): 7?12.

[4] Shan YB, Sheng WH, Yang JC, et al. Adenovirus mediated IL-24 gene expression inhibits growth of human glioma cell in vitro. Chin J Biotech, 2009, 25(2): 279?286.

單云波, 盛偉華, 楊吉成, 等. Ad-IL-24對人膠質(zhì)瘤細胞生長抑制效應的體外實驗. 生物工程學報, 2009,25(2): 279?286.

[5] Emdad L, Lebedeva IV, Su ZZ, et al. Melanoma differentiation associated gene-7/interleukin-24 reverses multidrug resistance in human colorectal cancer cells. Mol Cancer Ther, 2007, 6(11): 2985?2994.

[6] Wang XH, Miao JC, Xie YF, et al. Construction of adenovirus vector expressing IL-24 and E1A and its inhibition of SMMC-7721. Chin J Biotech, 2009, 25(7):1035?1041.

汪小華, 繆競誠, 謝宇鋒, 等. 腺病毒介導IL-24-ElA雙基因載體的構(gòu)建及其體外抑制SMMC-7721肝癌細胞生長作用初探. 生物工程學報, 2009, 25(7): 1035?1041.

[7] Lübbe AS, Alexion C, Bergemann C. Clinical application of magnetic drug targeting. J Surg Res, 2001, 95(2):200?206.

[8] Garkavtsev I, Kozin SV, Chernova O, et al. The candidate tumour suppressor protein ING4 regulates brain tumour growth and angiogenesis. Nature, 2004, 428(6980):328?332.

[9] Jiang H, Lin JJ, Su ZZ, et al. Subtraction hybridization identifies a novel melanoma differentiation associated gene, mda-7, modulated during human melanoma differentiation, growth and progression. Oncogene, 1995,11(12): 2477?2486.

[10] Inoue S, Branch CD, Gallick GE, et al. Inhibition of Src kinase activity by Ad-mda7 suppresses vascular endothelial growth factor expression in prostate carcinoma cells. Mol Ther, 2005, 12(4): 707?715.

[11] Huang EY, Madireddi MT, Gopalkrishnan RV, et al.Genomic structure, chromosomal localization and expression profile of a novel melanoma differentiation associated (mda-7) gene with cancer specific growth suppressing and apoptosis inducing properties. Oncogene,2001, 20(48): 7051?7063.

[12] Emdad L, Lebedeva IV, Su ZZ, et al. Melanoma differentiation associated gene-7/interleukin-24 reverses multidrug resistance in human colorectal cancer cells. Mol Cancer Ther, 2007, 6(11): 2985?2994.

[13] Yacoub A, Mitchell C, Lister A, et al. Melanoma differentiation-associated 7(interleukin 24) inhibits growth and enhances radiosensitivity of glioma cells in vitro and in vivo. Clin Cancer Res, 2003, 9(9): 3272?3281.

[14] Tse C, Shoemaker AR, Adickes J, et al. ABT-263: a potent and orally bioavailable Bcl-2 family inhibitor. Cancer Res,2008, 68(9): 3421?3428.

[15] Kerbel RS. Antiangiogenic therapy: a universal chemosensitization strategy for cancer? Science, 2006,312(5777): 1171?1175.

[16] Ma J, Waxman DJ. Combination of antiangiogenesis with chemotherapy for more effective cancer treatment. Mol Cancer Ther, 2008, 7(12): 3670?3684.

[10] Paesano R, Torcia F, Berlutti V, et al. Oral administration of lactoferrin increases hemoglobin andtotal serum iron in pregnant women. Biochem Cell Biol, 2006, 84(3):377?380.

[11] Liang QW, Richardson T. Expression and characterization of human lactoferrin in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Agric Food Chem, 1993, 41(10): 1800?1807.

[12] Zhang J, Li L, Cai Y, et al. Expression of active recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic goats. Protein Expr Purif, 2008, 57: 127?135.

[13] Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular Clonging: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[14] Zhao MT, Lin H, Liu FJ, et al. Efficiency of human lactoferrin transgenic donor cell preparation for SCNT.Theriogenology, 2009, 71: 376?384.

[15] He ZY, Yu SL, Li N, et al. Maternally transmitted milk containing recombinant human catalase provides protection against oxidation for mouse offspring during lactation. Free Radical BIO MED, 2008, 45: 1135?114.

[16] Zhang YL, Wan YJ, Wang F, et al. Production of dairy goat embryos, by nuclear transfer, transgenic for human acid β-glucosidase. Theriogenology, 2010, 73(5): 681?690.

[17] Robert E, Rhoads, Ewa GN. Translational regulation of milk protein synthesis at secretory activation. J Mammary Gland Bio Neoplasia, 2007, 12: 283?292.

[18] Cao Y, Gao HY, Yu L, et al. Studies of the clone and cell expression of human lactoferrin gene. Hereditas, 2002,24(1): 9?14.

曹陽, 高華穎, 于黎, 等. 人乳鐵蛋白基因克隆及細胞表達研究. 遺傳, 2002, 24(1): 9?14.

[19] Van Berkel PH, Welling MM, Geerts M, et al. Large scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows. Nat Biotechnol, 2002, 20(5): 484?487.

[20] Yang PH, Wang JW, Li N, et al. Cattle mammary bioreactor generated by a novel procedure of transgenic cloning for large-scale production of functional human Lactoferrin. PLoS One, 2008, 3(10): e3453.

Effect of adenovirus-mediated ING4 and IL-24 co-expression on chemosensitivity to human lung adenocarcinoma in vitro and in vivo

Yehan Zhu1, Xianrong Du1, Huaxin Chen1, Yufeng Xie2, Weihua Sheng2, and Jicheng Yang2
1 Department of Respiratory of the First Affiliated Hospital in Soochow University, Suzhou 215006, China
2 Molecular Biology Institute, College of Medicine, Soochow University, Suzhou 215123, China

Received: June 3, 2010; Accepted: September 25, 2010

Supported by: National Major Special Program of Breeding of Transgenetic Organisms New Variety (No. 2008ZX08008-004), The Opening Project of Animal Reproduction and Molecular Design Laborary of Jiangsu Province (No. YDKT0801).

Corresponding author: Feng Wang. Tel: +86-25-84395381; Fax: +86-25-84395314; E-mail: caeet@njau.edu.cn

國家“轉(zhuǎn)基因生物新品種培育”重大專項 (No. 2008ZX08008-004)，江蘇省動物繁育與分子設計實驗室開放課題 (No. YDKT0801) 資助。