李盛璞，師如意，王秋蘭，王牡，甘睿，潘潔，蔡繼業(yè)，張守全

1 暨南大學化學系，廣州 510632

2 華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642

3 暨南大學藥學院，廣州 510632

應用原子力顯微鏡分析豬脂肪前體細胞的分化

李盛璞1，師如意2，王秋蘭1，王牡1，甘睿3，潘潔1，蔡繼業(yè)1，張守全2

1 暨南大學化學系，廣州 510632

2 華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642

3 暨南大學藥學院，廣州 510632

脂肪形成過程中發(fā)生的異常變化與許多疾病的產(chǎn)生有著密切的關系。為深入了解脂肪形成的機制，利用原子力顯微鏡研究脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化前后細胞形貌、超微結構和機械性能的變化。結果表明，脂肪前體細胞與成熟脂肪細胞在形貌上存在明顯的差異。在超微結構的探測中成熟脂肪細胞表面粗糙度低于脂肪前體細胞。通過力曲線的分析得出，分化前后兩種細胞的機械性質均發(fā)生改變。脂肪前體細胞在粘彈力、硬度和楊氏模量的研究中比成熟脂肪細胞都高出約20%。原子力顯微鏡在納米尺度上分析脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化過程中細胞膜的改變，其研究結果為進一步探討脂肪形成機制提供可視化定量數(shù)據(jù)。

原子力顯微鏡，脂肪前體細胞，成熟脂肪細胞，超微結構，機械性能

Abstract:Abnormal changes during fat formation are closely related to the prevalence of many diseases. In order to understand the formation mechanism of fat, we used atomic force microscopy (AFM) to characterize the morphology and mechanical properties of porcine preadipocytes during the differentiation. Preadipocytes and adipocytes were different morphologically. The surface roughness of adipocytes was less than preadipocytes by detection of the ultrastructure. The mechanical properties of preadipocytes were changed during differentiation with AFM-based force spectroscopy. Preadipocytes were 20% higher than adipocytes in the adhesion force, stiffness and Young's modulus. Therefore, AFM analysis of membrane changes related to adipocytes formationprovided quantitative data in the nanometer level for further studying the formation mechanism of the adipocytes.Keywords:atomic force microscopy, preadipocytes, adipocytes, ultrastructure, mechanical properties

脂肪細胞不僅在生物體內(nèi)的能量平衡方面起著重要的作用，并且在荷爾蒙分泌和一些相關的脂肪因子，如：免疫應答、食欲調(diào)節(jié)、胰島敏感性、血管和骨架生長等方面也起著不可替代的作用[1]。脂肪的過度沉積會導致肥胖，不僅增加中老年人患高血壓、高血脂、Ⅱ型糖尿病、心血管等疾病的風險，并且還與許多癌癥發(fā)生的分子機制有關[2-3]。脂肪前體細胞是白脂肪組織的前體細胞，其分化為成熟的脂肪細胞又稱為脂肪形成，是伴隨細胞形態(tài)學、激素水平和基因表達協(xié)調(diào)變化的一個復雜的生物進程[4-5]。調(diào)節(jié)脂肪前體細胞的分化，進而使脂肪細胞脂肪含量的減少和脂肪細胞數(shù)目的減小，對肥胖病的治療有重要意義[6-7]。

細胞的形態(tài)、表面粗糙度和力學性質改變會影響細胞的性質、功能進一步引起疾病[8-9]。另一方面，疾病也能引起細胞結構和力學性質的變化[10]。因此細胞的形貌和力學性質的分析在更深層次研究生命活動、治療疾病方面發(fā)揮著重要的作用。原子力顯微鏡 (Atomic force microscope，AFM) 能夠在單細胞水平上對細胞的結構進行三維化和定量，獲得細胞表面結構和力學性質的定量數(shù)據(jù)，使得分析更全面[11-15]。文獻報道脂肪前體細胞分化為成熟脂肪細胞是一個復雜的過程，不是單純的脂滴形成。其分化過程中會產(chǎn)生不同的轉錄因子和蛋白等生物大分子，從而引起細胞膜的一系列變化[16]。故本實驗主要利用 AFM 研究豬脂肪前體細胞分化前后膜結構及其力學性質的改變，為更深入探討分化的調(diào)控機制和疾病產(chǎn)生提供定量的數(shù)據(jù)。研究結果也揭示了AFM是在微觀領域研究脂肪形成的一種有效工具。

1 材料與方法

1.1 材料

0.25%胰蛋白酶、1 mg/mL膠原蛋白酶Ⅰ、1%的青霉素、鏈霉素 (Sigma公司)，10% (V/V) 胎牛血清 FCS(Hyclone公司)，DMEM (Gibco BRL 公司)，50 nmol/L胰島素、50 nmol/L地塞米松、0.25 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 (IBMX)、50 μmol/L 油酸 (Sigma公司)。

1.2 脂肪前體細胞的分離培養(yǎng)

用 75%酒精進行仔豬全身消毒，之后用高壓滅菌的手術器械取 2日齡仔豬皮下脂肪組織，剪碎后采用膠原酶消化法：將膠原酶Ⅰ用無菌 PBS溶解，調(diào)整濃度為 1 mg/mL，在 37 ℃水浴搖床中消化1.5 h，搖床速率為100 r/min。之后用PBS清洗2次，1 000 r/min轉速下離心5 min。

將消化好的細胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，接種1~1.5 h后，將上清去掉，因為脂肪前體細胞的貼壁速度高于其他細胞，所以可以快速貼壁，用差速貼壁進行純化。之后用完全培養(yǎng)基10%FCS+DMEM(含 1%的雙抗) 進行培養(yǎng)，37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱，隔日換液，觀察細胞貼壁以及生長情況。2~3 d后細胞會長到80%左右，再進行消化傳代，消化時用 0.25%的胰酶進行消化，之后用等體積的含10% FCS完全培養(yǎng)基進行終止消化，1 000 r/min離心5 min，之后去掉上清，用不完全培養(yǎng)基DMEM進行清洗2次，此時繼續(xù)進行差速貼壁用以純化所得細胞。傳代2~3次后，就可以分離培養(yǎng)出細胞成分均一、增殖旺盛的脂肪前體細胞，經(jīng)2%臺盼藍檢查，細胞活性達到98%。

1.3 脂肪前體細胞的誘導分化

對所獲脂肪前體細胞采用含50 nmol/L胰島素、50 nmol/L地塞米松、0.25 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 (IBMX)、50 μmol/L油酸混合液的雞尾酒方法進行誘導，第2天時出現(xiàn)小脂滴，并開始融合成大脂滴。第4天之后完全形成成熟的脂肪細胞。

1.4 樣品制備

取脂肪前體細胞和誘導分化后的成熟脂肪細胞分別滴在玻片上，自然鋪展后吸附 10 min，先用pH 7.4的PBS緩沖液沖洗1次，然后用4% (質量分數(shù)) 的多聚甲醛固定 15 min，再用蒸餾水沖洗 3次，室溫自然干燥。

1.5 AFM成像

將制備好的樣品固定在 AFM (Autoprobe CP Research，veeco公司，USA) 的XY掃描臺上，用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域，在空氣中室溫下利用接觸模式成像。試驗中采用 100 μm掃描器，UL20B硅探針，力常數(shù)為2.8 N/m，AFM圖像僅經(jīng)自帶軟件 IP2.1 (Thermomicroscopes proscan image processing software version 2.1) 平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。利用 AFM力位移曲線測量系統(tǒng)在同一加載速率下測量得到力的曲線進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 倒置顯微鏡觀察脂肪前體細胞的分化

采用倒置顯微鏡對分離培養(yǎng)的豬皮下脂肪前體細胞及誘導分化后的成熟脂肪細胞分布進行觀察，發(fā)現(xiàn)分化前后細胞形貌無太大變化，均成不規(guī)則的長梭形或三角形 (圖1A和1B)，在誘導分化培養(yǎng)的第2天，用油紅O染色進行觀察，可以看見大量細胞有小的脂滴出現(xiàn)，分化率達95%以上。最初脂滴出現(xiàn)在核周，形似指環(huán)。隨著培養(yǎng)時間的延長，小脂滴逐漸聚集成葡萄串狀。第3天開始細胞內(nèi)的脂滴逐漸匯合形成大的脂滴。誘導4 d之后，細胞分化為成熟脂肪細胞。從倒置顯微鏡等儀器能宏觀了解分化前后細胞一些大的變化，而在分化的不同階段，細胞內(nèi)部表達出不同的轉錄因子和蛋白等生物大分子卻用肉眼觀察不到。這些微觀的變化和細胞膜的結構和機械性能有著密切的關系，用 AFM分析分化前后細胞結構和力學性質，用微觀輔助宏觀，進一步探測脂肪前體細胞向脂肪細胞分化的諸多變化。

2.2 AFM對脂肪前體細胞分化前后的形貌分析

AFM是樣品表面信息的收集工具，較易獲得細胞的形態(tài)、超微結構及其他一些表面信息。脂肪前體細胞向脂肪細胞分化的過程中，伴隨著形態(tài)、生物化學性質和分子層面上的變化，這些都將導致細胞膜的變化。因此，有必要探測細胞膜表面的信息。

用原子力顯微鏡對多個單獨細胞進行分析，拓撲圖顯示，脂肪前體細胞和成熟脂肪細胞均呈現(xiàn)不規(guī)則的長梭形或小三角形 (圖 2A 和 2F)，大小在40~70 μm之間，高度在350~650 nm之間。對局部小范圍掃描，局部拓撲圖2B和三維圖2D發(fā)現(xiàn)脂肪前體細胞上存在直徑約為1 μm大小的球狀結構，在成熟脂肪上并沒有觀察到。在分化后的成熟脂肪細胞上，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞核周圍出現(xiàn)大小不一的孔洞(圖2G和2I)，為脂肪形成過程中出現(xiàn)的空泡。圖2C和2H為兩種細胞膜上的超微結構，在2 μm×2 μm區(qū)域里，可以看出脂肪前體細胞膜表面顆粒分布比較突出和明顯，粒度分布圖2E顯示粒子大小主要分布在60 nm附近，分布均勻。而成熟脂肪細胞膜表面變得光滑，顆粒主要分布減小為18 nm左右 (圖2J)。選取多個不同的膜表面超微結構，利用 IP2.1分析軟件對其進行測量，得到幾何參數(shù)值 (表1)：分化前均方根粗糙度 (Rq)為 (30.82±9.69) nm、分化后為 (15.02±7.96) nm；平均粗糙度 (Ra) 在未分化時為(24.97±8.23) nm、分化后減小到 (12.09±6.14) nm。從總體的形態(tài)上看，脂肪前體細胞和成熟脂肪細胞的形貌沒有明顯的區(qū)別。但從超微結構中可以看出兩者有著明顯區(qū)別。利用原子力顯微鏡在納米級別上高分辨率的優(yōu)勢，分析得知分化之后膜表面變得光滑。

表1 脂肪前體細胞分化前后的超微結構參數(shù)Table 1 Comparison of ultrastructure parameter of preadipocytes and adipocytes

圖1 脂肪前體細胞分化前后的倒置顯微鏡圖Fig. 1 Inverted microscopy images of preadipocytes before and after differentiation. (A) Freshly plated preadipocytes (size: 400×).(B) preadipocytes after differentiation, black arrows shows the lipid droplet by oil red O staining (size: 400×).

圖2 脂肪前體細胞分化前后的AFM圖Fig. 2 AFM images of preadipocytes and adipocytes. (A–E) First group: AFM images of preadipocytes. (A) Topological morphology (size: 25 μm×25 μm). (B) Local membrane surface zoomed from (A) (size: 5 μm×5 μm). (C) Ultrastructure of the cell membrane surface zoomed from (A) (size: 2 μm×2 μm). (D) Three-dimensional morphology of (C). (E) Particles histogram of (C).(F–J) Second group: AFM images of adipocytes. (F) Topological morphology (size: 80 μm×80 μm). (G) Nuclei of adipocytes. (H)Ultrastructure of the cell membrane surface zoomed from (F) (size: 2 μm×2 μm). (I) Three-dimensional morphology of (H). (J) The particles histogram of (H). div: division.

2.3 AFM 對脂肪前體細胞分化前后的機械性能的分析

細胞各方面性質和能力的改變會導致機械性能的變化，而膜表面機械性質無法用肉眼看見。本實驗通過原子力顯微鏡測量得到的力-距離曲線來分析脂肪前體細胞和成熟脂肪細胞膜上的機械性質。由力曲線圖可得到細胞膜表面的粘附力、相對硬度和楊氏模量。圖3A和圖3B分別是脂肪前體細胞和成熟脂肪細胞的力曲線示意圖。

圖3 脂肪前體細胞分化前后的力曲線示意圖Fig. 3 Representative examples of force-distance curve acquired from preadipocytes and adipocytes, respectively. (A)Representative force curves of preadipocytes. (B)Representative force curve of adipocytes.

圖4 脂肪前體細胞分化前后機械性質的比較Fig. 4 The mechanical properties of preadipocytes and adipocytes. (A) Frequency-adhesion force histogram of preadipocytes, the adhesion force distributed in (146.33±11.23) PN. (B) Frequency-adhesion force histogram of adipocytes, the adhesion force distributed in (119.95±8.67) PN. (C) Histograms for stiffness of preadipocytes and adipocytes group (scanning size: 2 μm×2 μm). The cell stiffness is the slope of the retraction curve. Stiffness= Y(PN)/X(nm). (D) Histograms for Young’s modulus of preadipocytes and adipocytes group (scanning size: 2 μm×2 μm). Young’s modulus E=3F(1–ν2) /4(Rδ3)1/2[17-18]. F is the adhesion force,νis the Poisson’s ratio, R is the radius of the probe, and δ is indentation depth.

通過力曲線得出粘附力的分布范圍，脂肪前體細胞粘附力較大，分布在 (146.33±11.23) PN，而成熟脂肪細胞粘附力較低，分布在 (119.95±8.67) PN (圖4A和4B)。硬度是表征細胞膜表面力學性質的一個重要參數(shù)，它反映的是剛性隨形變的變化，諸多文獻報道其與細胞骨架有很大關系。圖 4C是分化前后細胞硬度的對比。脂肪前體細胞的硬度 (2.58±0.41) mN/m比成熟脂肪細胞 (2.05±0.19) mN/m高出約20%。圖4D是脂肪前體細胞組和成熟脂肪細胞組的楊氏模量對比，楊氏模量反映了細胞膜表面的剛性。脂肪前體細胞組的楊氏模量 (1.05±0.09) kPa也高于成熟脂肪細胞組 (0.87±0.06) kPa約20%。

細胞膜上有很多膜蛋白和脂多糖等生物大分子顆粒。從AFM對成脂分化前后細胞膜表面超微結構的分析可得，脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化后，膜逐漸變得光滑，粗糙度降低，表面顆粒減小，成熟脂肪細胞膜上與原子力顯微鏡的針尖相互作用的生物大分子顆粒減少，所以粘附力低于脂肪前體細胞。細胞骨架由微絲、微管和肌動蛋白等構成，其變化影響細胞膜的硬度，從而影響膜的流動性。脂肪前體細胞向脂肪細胞分化后，細胞骨架發(fā)生變化，硬度降低，膜流動性增加，說明成熟脂肪細胞比起脂肪前體細胞，膜流動性有所增強。剛性也是細胞形變的一個參數(shù)，楊氏模量越大，細胞越不易變形。成熟脂肪細胞比脂肪前體細胞楊氏模量小，說明成脂分化后的細胞更易變形。

3 結論

原子力顯微鏡是分析成脂分化前后細胞膜表面超微結構和力學性質的一種有效工具。脂肪細胞在體外經(jīng)過分化而形成的過程與體內(nèi)脂肪組織分化產(chǎn)生的基因表達、蛋白變化過程具有非常類似之處。通過 AFM 在體外研究雞尾酒法誘導脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞的分化，清楚地觀察到分化前后細胞形貌和膜表面超微結構的改變，同時對力曲線進行分析，發(fā)現(xiàn)膜表面粘附力、硬度、楊氏模量的變化。脂肪前體細胞在分化后，膜表面變得光滑，粗糙度減小，顆粒大小降低，膜表面粘附力由(146.33±11.23) PN 降低到 (119.95±8.67) PN。而硬度與楊氏模量方面，脂肪前體細胞也比成熟脂肪細胞高約20%。對脂肪細胞過程中細胞膜的研究結果說明，成熟脂肪細胞比脂肪前體細胞更易變形，膜的流動性更強。AFM 以其在納米級別的高分辨優(yōu)勢，獲得的可視化圖像和定量數(shù)據(jù)有助于全面了解脂肪前體細胞向脂肪細胞的分化過程和分化機制。

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Analysis of porcine preadipocytes differentiation by atomic force microscope

Shengpu Li1, Ruyi Shi2, Qiulan Wang1, Mu Wang1, Rui Gan3, Jie Pan1, Jiye Cai1,and Shouquan Zhang2
1 Department of Chemistry, Jinan University, Guangzhou 510632, China
2 College of Animal Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
3 College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Received: April 20, 2010; Accepted: July 12, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 20676130).

Corresponding author: Mingbo Gao. Tel: +86-411-87656219; E-mail: lily@dlnu.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 20676130) 資助。