林燕環(huán)，魏 芳，葉冰瑩，張積森，陳由強

(福建師范大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良重點開放實驗室，福建 福州 350108)

可再生生物能源能夠替代不可再生能源，支持可持續(xù)發(fā)展的能源，具有重大現(xiàn)實意義。目前隨著能源危機的加劇，在產(chǎn)業(yè)規(guī)模方面發(fā)展最快的是燃料乙醇[1]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇發(fā)酵的主要菌種[2]。因此獲得乙醇高產(chǎn)菌株是其發(fā)展方向。在釀酒酵母中與乙醇代謝相關(guān)的乙醇脫氫酶由ADH1－ADH5編碼，其中ADH2催化乙醇氧化為乙醛，其他4個編碼基因催化乙醛還原成乙醇[3－5]。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，當葡萄糖被消耗完后，ADH2開始催化利用乙醇作為碳源[6]。因此，破壞ADH2催化的乙醇分解代謝反應，提高釀酒酵母合成乙醇的能力是可行的。目前主要利用基因敲除技術(shù)敲除ADH2基因，一些研究表明ADH2基因敲除突變株遺傳穩(wěn)定性差[2]。本文利用重疊延伸PCR方法，構(gòu)建了釀酒酵母ADH2基因沉默的表達載體，以期獲得高產(chǎn)的乙醇突變株并能克服遺傳穩(wěn)定差的缺點。

1 材料與方法

1.1 菌種及質(zhì)粒載體

工業(yè)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和大腸桿菌DH5α由福建師范大學生命科學學院農(nóng)業(yè)部甘蔗生理遺傳開放重點實驗室提供。pUG6和表達載體pYES2.0由福建師范大學工業(yè)微生物教育部工程研究中心惠贈。

1.2 酶和主要試劑

高保真酶、rTaq酶、T4DNA連接酶、KpnⅠ和NotⅠ均購于Takara公司。凝膠純化試劑盒購自Promega公司。PCR引物由上海生工公司合成。DNA測序由TAKARA公司完成。

1.3 引物設計

根據(jù)重疊延伸PCR的原理設計引物[7]，合成以下2對引物。(1)P1:5'-CGGGGTACCAGCTACAAAAAGCATACAATCAACT-3'，P2:5'-GCGTACGAAGCTTCAGCTGGCCCTTAACGTTTTCACCCATGCCG-3';(2)F1:5'-CAGCTGAAGCTTCGTACGC-3'，F(xiàn)2:5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3'。

其中P1引物為5'UTR序列前25個堿基，且在5'端引入KpnⅠ的酶切位點;P2引物中5'端前19個堿基與Kanr基因序列前19個堿基互補;F1引物為Kanr基因序列前19個堿基;F2引物與Kanr基因序列3'端23個堿基互補，并在5'端引入NotⅠ酶切位點及保護堿基。

1.4 重疊延伸PCR擴增沉默組件

該沉默組建需要3個PCR反應來完成。首先以釀酒酵母Y01基因組為模板，P1、P2為上下游引物，進行PCR擴增ADH2基因的5'UTR(PCR1)，同時以質(zhì)粒PUG6為模板，F(xiàn)1、F2為上下游引物，進行PCR擴增KanMX(PCR2)。PCR1、PCR2的反應用高保真酶，按標準方法以50 μL體系進行擴增，將 PCR1、PCR2的產(chǎn)物按照膠回收試劑盒推薦方法進行純化回收。然后取PCR1的純化產(chǎn)物1 μL，PCR2的純化產(chǎn)物0.4 μL為模板，以P1、F2為上下游引物，進行第3個PCR(PCR3)。通過第3個PCR，用外側(cè)引物將 片段5'UTR和KanMX完成拼接。具體的擴增程序參照表1。

表1 PCR反應條件Table1 PCR reaction conditions

1.5 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

通過KpnⅠ、NotⅠ分別將空表達載體pYES2.0和插入片段雙酶切，連接獲得表達質(zhì)粒，構(gòu)建圖1。

圖1 釀酒酵母表達載體pSADH2構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of the silencing expression vector

1.6 ADH2基因沉默表達載體pSADH2的構(gòu)建與鑒定

將上述PCR3擴增得到的重疊延伸PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。將鑒定為正確的片段膠回收純化后，用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切，回收約1942 bp的片段，與經(jīng)KpnⅠ和NotⅠ雙酶切純化的表達載體pYES2.0過夜連接;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB平板。挑取白色菌落，37℃ 200 r·min－1搖菌過夜，提取質(zhì)粒，進一步用酶切和測序鑒定。陽性重組質(zhì)粒命名為pSADH2。

2 結(jié)果

2.1 PCR

分別用引物P1、P2和F1、F2進行PCR擴增獲得ADH2基因的5'UTR基因和KanMX基因。然后，以這2個片段為模板，以P1、F2為引物重疊延伸PCR獲得融合片段。電泳結(jié)果(圖2)表明，PCR擴增出5'UTR基因、KanMX基因及其融合片段與預期的理論值大小相符，可用于后續(xù)的研究。

2.2 ADH2基因沉默表達載體pSADH2的鑒定

新構(gòu)建的沉默表達載體pSADH2共7797 bp，以pYES2.0為載體，帶有沉默ADH2基因以及G418的抗生素標記基因，可以用G418來篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌株。

提取構(gòu)建的沉默表達載體pSADH2質(zhì)粒DNA，根據(jù)其多克隆位點進行酶切鑒定，用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ分別對其單酶切和雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3。

圖2 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR product

圖3 pSADH2質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis pattern of the plasmid pSADH2 digested by restriction digestion

2.3 ADH2基因沉默表達載體pSADH2的序列測序鑒定

提取構(gòu)建的沉默表達載體pSADH2質(zhì)粒DNA測序結(jié)果(圖4)與pUG6上KanMX基因與ADH2的5'UTR序列完全相符。通過以上結(jié)果分析，構(gòu)建的ADH2沉默表達載體pSADH2結(jié)構(gòu)正確，可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化試驗。

3 討論

本研究采用重疊延伸PCR成功構(gòu)建了釀酒酵母ADH2基因沉默表達載體。重疊延伸PCR技術(shù)已被廣泛應用，不僅可以應用于擴增長片段基因、定點突變和基因敲除等，而且在定點突變上的應用具有突變效率高、操作簡單、成本低等優(yōu)點[8]，但仍存在一些需要解決的問題。由于延伸獲得的片段是經(jīng)PCR擴增產(chǎn)生的，因此拼接的準確性一定程度上受PCR反應保真度的影響，并且該技術(shù)操作過程中很大一部分靠經(jīng)驗的指導，并沒有標準的操作條件，對擴增未知序列仍然有一定的困難。

圖4 測序結(jié)果Fig.4 The result of sequence

pYES2.0質(zhì)粒是釀酒酵母穿梭載體，自身帶有GAL1啟動子、URA3和Amp抗性標記基因便于篩選。pYES2.0質(zhì)粒屬于非整合型載體，插入片段需帶有啟始編碼子和終止子，含有多個克隆位點便于外源片段的插入，目前廣泛運用于釀酒酵母內(nèi)重組蛋白的表達。經(jīng)酶切及序列分析可知，本研究已成功構(gòu)建了釀酒酵母ADH2基因沉默表達載體pSADH2，可以進一步進行轉(zhuǎn)化釀酒酵母及表達量的研究。

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