趙 旭，劉向國，王愛榮，3

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002;2.福州市園林科學(xué)研究院，福建 福州 350003;3.福建農(nóng)林大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息學(xué)院，福建 福州 350002)

DnaJ結(jié)構(gòu)域是個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域，大約由70個(gè)氨基酸組成，其核心結(jié)構(gòu)是組氨酸/脯氨酸/天冬氨酸(His/Pro/Asp，HPD)三肽[1]。含有DnaJ結(jié)構(gòu)域的蛋白統(tǒng)稱為DnaJ蛋白。DnaJ蛋白作為輔助蛋白通過激活熱激蛋白70的ATP酶活性而調(diào)控其活性，在細(xì)胞內(nèi)具有多種功能，包括新生蛋白的折疊、胞吞作用、多肽穿過細(xì)胞器質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)整對(duì)各種脅迫的反應(yīng)及對(duì)預(yù)降解蛋白的靶定等[2-4]。在大多數(shù)生物中都發(fā)現(xiàn)存在類似DnaJ的蛋白。目前，DnaJ蛋白分為三類[3]:第一類具有最早發(fā)現(xiàn)的DnaJ蛋白結(jié)構(gòu)，含有4種結(jié)構(gòu)域:N端的DnaJ結(jié)構(gòu)域、富含甘氨酸和苯丙氨酸區(qū)域(G/F結(jié)構(gòu)域)、含有4個(gè)Cys-X-X-Cys-XGly-X-Gly基序的富含半胱氨酸(CR)結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域(CTD);第二類只有3種結(jié)構(gòu)域，即:DnaJ結(jié)構(gòu)域、G/F結(jié)構(gòu)域和CTD結(jié)構(gòu)域;第三類只有DnaJ結(jié)構(gòu)域具有同源性，除了DnaJ結(jié)構(gòu)域外，可能還含有其他各種結(jié)構(gòu)域。

各種生物中的DnaJ蛋白數(shù)目不同，酵母中有22個(gè)[3]，人細(xì)胞中有41個(gè)[5]，擬南芥中至少有89個(gè)[6]。迄今，已有幾個(gè)水稻DnaJ基因被分離并進(jìn)行了功能鑒定[7-8]，但尚未見水稻中DnaJ蛋白的相關(guān)報(bào)道。本文對(duì)水稻DnaJ家族成員進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，以期更清晰地了解該類蛋白的結(jié)構(gòu)、種類和功能。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫搜索

在水稻數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_domain.shtml)中輸入 DnaJ或其Pfam 號(hào)(PF00226)進(jìn)行搜索，再用 InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)和 Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)對(duì)所獲得的蛋白氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。將缺少DnaJ結(jié)構(gòu)域及缺少保守的HPD的蛋白除去。

1.2 蛋白表達(dá)證據(jù)分析

在 http://rice.plantbiology.msu.edu/expression_expressed.shtml數(shù)據(jù)庫中，輸入編碼 DnaJ蛋白的基因ID號(hào)，提交后得到基因表達(dá)的各種證據(jù)結(jié)果，對(duì)該結(jié)果進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

多序列比對(duì)用軟件ClustalX 1.83進(jìn)行，所生成的.aln文件用軟件 Mega3.1轉(zhuǎn)換成.meg文件，然后采用鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行1000次Boot strap抽樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻中DnaJ蛋白的鑒定與分類

通過保守結(jié)構(gòu)域的搜索，并剔除沒有HPD核心區(qū)的序列，發(fā)現(xiàn)水稻中有101個(gè)編碼DnaJ蛋白的基因。結(jié)構(gòu)域搜索發(fā)現(xiàn)，3類DnaJ蛋白在水稻中均存在。第三類蛋白根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的不同可分為13亞類，其中，成員最多的一類是只含有DnaJ結(jié)構(gòu)域且其位于N末端或偏向中間位置的蛋白;成員數(shù)第二的一類也是只含有DnaJ結(jié)構(gòu)域，但其位于C末端而不同于位于N末端的其他蛋白，這類蛋白被稱為輔助蛋白[9];成員數(shù)第三的一類蛋白中除含有DnaJ結(jié)構(gòu)域外，還含有1-2個(gè)DUF3444結(jié)構(gòu)域;其余幾類中僅含有1-2 個(gè)蛋白，它們除了 DnaJ結(jié)構(gòu)域外，還分別含有 3395、zf-C2H2 jaz、zf-CSL、DUF1977、Sec63、RRM1、DUF3752、Dehydrin或者另外一個(gè)DnaJ結(jié)構(gòu)域。

在搜索水稻DnaJ蛋白的同時(shí)，我們也搜索了擬南芥基因組中的DnaJ基因，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥中有104個(gè)編碼DnaJ蛋白的基因，而不是89個(gè)[6]。除了水稻中Os03g62120蛋白具有2個(gè)DnaJ結(jié)構(gòu)域外，其他水稻的DnaJ蛋白都可以在擬南芥中找到對(duì)應(yīng)的DnaJ蛋白同源物。此外，擬南芥中的AT4G19580蛋白含有WCCH結(jié)構(gòu)域，但水稻中缺乏類似的結(jié)構(gòu)域(表1)。

表1 水稻DnaJ蛋白及其表達(dá)證據(jù)分析1)Table1 The expression evidences and classes of rice DnaJ proteins

續(xù)表

續(xù)表

2.2 水稻DnaJ蛋白的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步分析水稻DnaJ蛋白成員，我們?cè)趆ttp://rice.plantbiology.msu.edu/expression_expressed.Shtml數(shù)據(jù)庫中搜索了基因表達(dá)證據(jù)。搜索結(jié)果還提供了每一個(gè)家族成員的不同轉(zhuǎn)錄本數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分水稻DnaJ基因至少有1個(gè)證據(jù)證明其是表達(dá)的，最高的多達(dá)910個(gè)EST。只有Os07g28800、Os11g36530、Os09g20320、Os03g62150、Os03g62140、Os03g62130、Os03g20730、Os02g35000、Os01g17040、Os01g17030和Os03g62120共11個(gè)基因沒有表達(dá)證據(jù)(表1)。僅有少數(shù)基因有2個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄本，其中17個(gè)基因有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，13個(gè)基因有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，僅Os02g54130有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其余都為1個(gè)轉(zhuǎn)錄本。

2.3 水稻DnaJ蛋白的進(jìn)化分析

為了分析水稻DnaJ蛋白之間以及與擬南芥DnaJ蛋白之間的親緣關(guān)系，我們?yōu)榈谝活惻c第二類的DnaJ蛋白建立了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果表明，第一類與第二類明顯分為兩大群，第二類蛋白只有1個(gè)大亞群(圖1)。第一類的又細(xì)分為 3個(gè)亞群:Os05g26926、Os05g26902和 Os05g26914、Os03g12236、Os02g56040與擬南芥的 AT2G22360、AT4G39960、AT3G17830、AT1G80030聚在一起，形成第一亞群，且Os05g26926、Os05g26902和Os05g26914高度同源，推測這3個(gè)水稻基因是通過基因的重復(fù)拷貝而獲得;Os06g11440、Os06g02620、Os12g07060和擬南芥的 AT1G28210、AT5G48030聚在一起形成第二亞群;Os12g42440、Os04g46390、Os03g57340、Os03g44620、Os02g43930 與擬南芥的 AT3G44110、AT5G22060 形成第三亞群。從圖1可以看出，每個(gè)水稻基因幾乎都至少有1個(gè)最同源的擬南芥基因。

圖1 第一類與第二類DnaJ蛋白的進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree of type 1 and type 2 DnaJ proteins

3 結(jié)論與討論

DnaJ蛋白是個(gè)很大的蛋白家族，本研究中發(fā)現(xiàn)水稻中有101個(gè)編碼該類蛋白的基因，擬南芥中有103個(gè)DnaJ基因，而不是前人所報(bào)道的89個(gè)[6]。水稻和擬南芥中該蛋白家族和其他生物的類似，根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的不同可以分為三大類。而每一個(gè)水稻的基因都至少有1個(gè)最同源的擬南芥基因，這說明該類蛋白家族的進(jìn)化早于單子葉植物與雙子葉植物的進(jìn)化，這種現(xiàn)象在其他蛋白家族中普遍存在[10，11]。

表達(dá)證據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，除了11個(gè)基因沒有表達(dá)證據(jù)外，其他基因都至少有1個(gè)表達(dá)證據(jù)，最多的達(dá)到910個(gè)，這說明DnaJ蛋白可能在水稻的整個(gè)生育期中起著重要的調(diào)控作用，是一類不可缺少的蛋白。

[1]KELLEY W L.The J-domain family and the recruitment of chaperone power[J].Trends Biochem Sci，1998，23:222-227.

[2]CYR D M，LANGER T，DOUGLAS M G.DnaJ-like proteins:molecular chaperones and specific regulators of Hsp70[J].Trends Biochem Sci，1994，19:176-181.

[3]WALSH P，BURSA? D，LAW Y C，et al.The J-protein family:modulating protein assembly，disassembly and translocation[J].EMBO Rep，2004，5:567-571.

[4]LIBEREK K，LEWANDOWSKA A，ZIETKIEWICZ S.Chaperones in control of protein disaggregation[J].EMBO J，2008，27(2):328-335.

[5]QIU X B，SHAO Y M，MIAO S，et al.The diversity of the DnaJ/Hsp40 family，the crucial partners for Hsp70 chaperones[J].Cell Mol Life Sci，2006，63(22):2560-2570.

[6]MIERNYK J A.The J-domain proteins of Arabidopsis thaliana:an unexpectedly large and diverse family of chaperones[J].Cell Stress ＆ Chaperones，2001，6(3):209-218.

[7]YAMAMOTO T，MORI Y，ISHIBASHI T，et al.Interaction between proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and a DnaJ induced by DNA damage[J].J Plant Res，2005，18(2):91-97.

[8]LU L，DU Z，QIN M，et al.Pc4，a putative movement protein of Rice stripe virus，interacts with a type I DnaJ protein and a small Hsp of rice[J].Virus Genes，2009，38(2):320-327.

[9]LEMMON S K.Clathrin uncoating:auxilin comes to life[J].Curr Biol，2001，11:R49-R52.

[10]王愛榮，劉向國，趙旭，等.水稻腈水解酶蛋白家族的生物信息學(xué)分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(23):52-57.

[11]金谷雷，汪旭升，朱軍.水稻14-3-3蛋白家族的生物信息學(xué)分析[J].遺傳學(xué)報(bào)，2005，32(7):726-732.