馬大中，鄭白水，李 紅，楊文峰，陳長俞

(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，遼寧 沈陽 110027)

DY桿菌發(fā)酵工藝研究

馬大中，鄭白水，李 紅，楊文峰，陳長俞

(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，遼寧 沈陽 110027)

目的 提高生產(chǎn)代碼為DY桿菌的發(fā)酵質(zhì)量。方法 改進DY桿菌發(fā)酵工藝流程，由原來一級發(fā)酵改為二級發(fā)酵，并調(diào)整通氣量為16 m3/h。結(jié)果 新工藝的DY桿菌發(fā)酵活性較原工藝提高了40%，物料消耗為原工藝的75%，發(fā)酵周期平均縮短了4 h，綜合降低生產(chǎn)成本60%。結(jié)論 新工藝更適合于菌種的繁殖和芽孢的形成，值得應(yīng)用和推廣。

DY桿菌;發(fā)酵工藝;二級發(fā)酵;芽孢形成率

我公司生產(chǎn)的代碼為DY的桿菌，屬兼性厭氧菌，進入腸道后，可通過生物奪氧和生物拮抗作用，促進腸道益生菌的生長，抑制腸道致病菌的生長，從而調(diào)整腸道菌群失調(diào)，可用于某些腸道疾病的治療[1－2]。DY桿菌的菌體通過液體深層培養(yǎng)、微生物發(fā)酵獲得，自1998年生產(chǎn)以來，產(chǎn)品雖穩(wěn)定性良好，但仍存在發(fā)酵周期各批次差異較大的問題。公司引進了自動化監(jiān)控系統(tǒng)對產(chǎn)品進行升級改造，將各項發(fā)酵參數(shù)都設(shè)定在可監(jiān)測范圍內(nèi)，這為發(fā)酵各項指標的優(yōu)化提供了基礎(chǔ)。為此，筆者對DY桿菌的發(fā)酵工藝進行了研究與改進，考察不同工藝條件下的發(fā)酵產(chǎn)量及活性，確立了更好的發(fā)酵工藝，效果較為理想，實現(xiàn)了降低成本、節(jié)降能耗、提高發(fā)酵質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:代碼為DY的芽孢桿菌。

培養(yǎng)基:肉湯培養(yǎng)基，以蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、牛肉膏0.5%、純化水配制，調(diào)節(jié) pH至中性;分離培養(yǎng)基，以蛋白胨1.0%、牛肉膏 0.5%、氯化鈉 0.5% 、瓊脂粉 1.6%、純化水配制，調(diào)節(jié)pH至中性;發(fā)酵培養(yǎng)基以蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%、一級水配制，調(diào)節(jié)pH至中性。

1.2 方法

1.2.1 DY桿菌生產(chǎn)

斜面種子制備:將原始菌株接種入肉湯培養(yǎng)基，于(37±1)℃恒溫培養(yǎng)若干小時進行活化，采用劃線分離方法，培養(yǎng)形成單菌落。對其進行生化反應(yīng)、菌體形態(tài)及菌落形態(tài)鑒定，進行斜面接種，制備工作種子批。將制備的斜面種子在2～8℃冰箱中保存，備用。

生產(chǎn)種子液制備:挑取斜面種子，接種到肉湯培養(yǎng)基中，在(37±1)℃恒溫搖瓶柜上培養(yǎng)，制備成生產(chǎn)種子液。

發(fā)酵:按原工藝、新工藝流程對比試驗的不同方案，將生產(chǎn)種子液分別接種到發(fā)酵罐中，于(37±1)℃發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 原菌粉制備

取離心后的發(fā)酵菌泥與輔料，按照一定比例混勻，低溫烘干。取樣，待檢。

1.2.3 菌粉活性測定

按照平板菌落計數(shù)法測定菌粉活性。取發(fā)酵離心后制備好的原菌粉若干，加入含玻璃珠的無菌肉湯中，在搖床上振蕩20 min，制備原菌液;取若干支試管，各裝入適量肉湯，采用梯度稀釋法，逐級稀釋至10－7～10－8。分別取稀釋后的菌液1 mL，置于平皿中，倒入溶解好的營養(yǎng)瓊脂。待瓊脂凝固后，倒置放入(37±1)℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取出平板，計算菌落數(shù)。

1.2.4 兩種工藝流程對比試驗

原生產(chǎn)工藝(一級發(fā)酵，通氣量20 m3/h)與新生產(chǎn)工藝(二級發(fā)酵，通氣量16 m3/h)的流程圖見圖1及圖2。按照生產(chǎn)工藝流程，考察發(fā)醇過程中培養(yǎng)基濃度、發(fā)酵周期及芽孢形成率等各參數(shù)，發(fā)酵結(jié)束后考察菌粉活性，同時兼顧生產(chǎn)成本(每罐)。

圖1 DY桿菌原生產(chǎn)工藝流程

圖2 DY桿菌新生產(chǎn)工藝流程

1.2.5 發(fā)酵時通氣量影響試驗

發(fā)酵時通氣量的大小對DY桿菌的生長和芽孢的形成影響巨大。采用新工藝，選取不同的通氣量(8，12，16，20，24 m3/h)來考察發(fā)酵的效果。

2 結(jié)果

2.1 生長曲線對比

結(jié)果見圖3。

圖3 生長曲線圖

2.2 考察項目數(shù)據(jù)對比

表1 原工藝與新工藝考察項目數(shù)據(jù)對比(每罐)

結(jié)果見表1?？梢姡鹿に囍型度氲纳a(chǎn)原料減少，發(fā)酵周期縮短，實罐滅菌時間減少，既節(jié)省了人力成本，又減輕了對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞，使得發(fā)酵后期芽孢形成率有所提高，菌粉活性同時得以改善。

2.3 發(fā)醇時通氣量影響試驗

結(jié)果見表2?？梢?，通氣量為16 m3/h時最有利于DY桿菌的生長。

表2 發(fā)酵時通氣量影響試驗結(jié)果

3 討論

細菌的生長分為延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期4個時期。我公司生產(chǎn)的DY桿菌營養(yǎng)體繁殖主要在對數(shù)期，芽孢的形成在穩(wěn)定期。改進工藝的目的是為了獲得盡可能多的成熟芽孢。營養(yǎng)豐富、條件適宜、繁殖迅速，營養(yǎng)體自然多;營養(yǎng)體能處于同步生長狀態(tài)，且能在最短時間內(nèi)達到饑餓狀態(tài)，這也是芽孢形成的關(guān)鍵。

圖1細菌生長曲線顯示，原工藝細菌生長繁殖速度較慢，達到最高濃度用時較長;而新工藝在培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、通氣效果方面較好，故繁殖速度快、代時短，且處于同步生長狀態(tài)，能快速達到最高濃度，大大縮短了對數(shù)期時間，為整個運行周期的縮短奠定了基礎(chǔ)。另外，原工藝細菌在穩(wěn)定期的生長時間也較長，且活性有逐漸遞減的趨勢，這是因為該菌達到最高濃度時，菌齡差異較大，且培養(yǎng)基內(nèi)有些營養(yǎng)成分仍很豐富，細菌有的繼續(xù)生長繁殖，有的死亡溶解，待營養(yǎng)消耗殆盡時，才開始陸續(xù)形成芽孢，而此時代謝產(chǎn)物增多，抑制細菌生長成熟的有毒物質(zhì)積聚，所以其芽孢形成率和活性都在降低;而新工藝既能滿足對數(shù)期營養(yǎng)豐富、條件適宜的要求，又能滿足穩(wěn)定期營養(yǎng)不足對芽孢形成的促進作用，導致芽孢形成速率和形成率都更好。因此，新工藝更適合于菌體的繁殖和芽孢的形成，值得應(yīng)用和推廣。

對于新工藝，筆者中試了5批產(chǎn)品，無論從菌量還是活性上都高于原工藝;且對其菌粉進行了全面的生化反應(yīng)鑒定，均符合菌種特性。在整個工藝改進過程中，未引入影響菌種誘變的因素，因此完全可以保證菌種的穩(wěn)定性。另外，還通過追蹤多批成品，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品活性的穩(wěn)定取決于芽孢的形成率和成熟度，而這正是新工藝的優(yōu)勢所在，因此新工藝產(chǎn)品活性的穩(wěn)定性毋庸置疑。

[1]吳鐵林，白日彭，駱稽酉，等.地衣芽孢桿菌20 368株特性及其生態(tài)制劑的研究[J].中國微生物學雜志，1990，2(2):1－12.

[2]吳鐵林，張劍君，白日彭，等.應(yīng)用地衣芽孢桿菌調(diào)治腸道菌群失調(diào)的研究[J].解放軍醫(yī)學雜志，1989，14(3):199－201.

R915;TQ460.6

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1006－4931(2011)03－0032－02

2010－04－12;

2010－10－25)