張春雪，閔鶴鳴，閔連秋

(1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內科，錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學院基礎學院，錦州 121001)

2-脫氧葡萄糖誘導大鼠內質網(wǎng)應激預處理模型的最佳劑量

張春雪1，閔鶴鳴2，閔連秋1

(1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內科，錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學院基礎學院，錦州 121001)

目的 探討2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-glucose，2-DG)誘導大鼠內質網(wǎng)應激模型的最佳劑量。方法 選擇Wistar雄性大鼠108只，體質量240～260 g，采用不同劑量2-DG建立大鼠內質網(wǎng)應激的模型，隨機分為6組：2-DG 50、100、150、200 mg/kg組，假手術組，缺血再灌注組。2-DG組按工作濃度為50 mg/mL溶于雙蒸水腹腔注射7 d，假手術組和缺血再灌注組腹腔注射雙蒸水7 d，于腦缺血再灌注后12 h處死，對各組大鼠進行神經(jīng)行為學評分，采用HE染色觀察腦組織的病理形態(tài)，免疫組化法和Westernblot法測定GRP78蛋白的表達，用PCR法檢測GRP78 mRNA的表達。結果 與腦缺血再灌注組相比，2-DG各劑量組大鼠的神經(jīng)行為學評分明顯減低(P＜0.01)，而以100 mg/kg組評分減低最為明顯(P＜0.05);2-DG各劑量組能不同程度的改善大鼠腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的核深染、核固縮程度，減少細胞及間質的水腫，使胞膜趨于清楚、形態(tài)接近正常、核仁清晰可見的神經(jīng)細胞數(shù)目增多，而以2-DG100 mg/kg組的效果最為明顯。2-DG各劑量組GRP78蛋白表達明顯增加，與腦缺血再灌注組比較，差異有顯著性(P＜0.01)，而以100 mg/kg劑量組的GRP78蛋白表達最高，與其他2-DG劑量組比較差異有顯著性(P＜0.05)。結論 2-DG對腦缺血再灌注所致的神經(jīng)細胞損傷具有保護作用，其最佳劑量為100 mg/kg。2-DG具有誘導大鼠內質網(wǎng)應激的作用，其最佳劑量是100 mg/kg。

2-脫氧葡萄糖;內質網(wǎng)應激;大鼠;模型，動物

內質網(wǎng)是人體新合成蛋白進行折疊、組裝、翻譯后修飾和 Ca2+儲存的主要場所［1］，其生理功能易受內外環(huán)境的變化如缺血、缺氧、Ca2+耗竭、葡萄糖/營養(yǎng)缺乏、蛋白質轉運異常、氧化應激等的影響，導致內質網(wǎng)功能紊亂及相關反應稱為內質網(wǎng) 應 激 (endoplasmic reticulum stress，ERS)［1，2］。凡是影響內質網(wǎng)功能的因素幾乎都能引起ERS，如營養(yǎng)物質缺乏、干擾蛋白質翻譯、影響內質網(wǎng)鈣離子平衡、蛋白結構異常以及缺氧、病毒感染、抑制內質網(wǎng)和高爾基體之間囊泡轉運的藥物等。目前國內外對ERS的研究比較多，誘導ERS的藥物也種類繁多，但是對其應用的最佳劑量尚未見報道。本實驗試圖確定2-DG誘導大鼠內質網(wǎng)應激預處理模型的最佳劑量。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

選擇SD雄性大鼠108只，體質量240～260 g，來源于遼寧醫(yī)學院實驗動物中心【SCXK(遼)2003-0007】。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。每籠2只喂養(yǎng)，動物自由飲食，在基礎學院2級動物實驗室(室溫22℃，濕度45%)喂養(yǎng)一周，適應環(huán)境后開始實驗。藥品：2-DG購于天津致遠公司;GRP78一抗、二抗購于北京博奧森試劑公司;Trizol試劑，逆轉錄酶，Tag酶等PCR試劑購于大連寶生物。LEICA-RM-2135石蠟切片機：德國萊卡;CSIV型攤片烤片機：孝感市電子儀器廠;恒溫水浴箱：湖北黃石儀器廠;BH/CH20BIMF200顯微鏡：日本奧林巴斯;CIAS-1000型圖像分析儀：北京大恒圖像視覺有限公司等。

1.2 分組與給藥

108只大鼠隨機分成6組，每組18只大鼠：假手術組、腦缺血再灌注(I/R)組、2-DG組4個劑量組(2-DG：50、100、150 和 200 mg/kg)。大鼠大腦中動脈缺血模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的制備參照 Zea Longa［3］法并加以改進，用線栓阻斷左側MCA的血液供應。用10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，頸部正中切口，手術顯微鏡下，暴露左側頸總動脈，分離右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，結扎ECA的根部，用動脈夾夾閉ICA遠端，在左側 CCA分叉處的下方剪一小口，插入已知長度的碳素魚線(線前端預先加熱成光滑的橢圓形，直徑為(0.18±0.20)mm，去除動脈夾，緩慢推進線栓約(18±2)mm，感到有輕微阻力時停止，扎緊結扎線并固定插線。缺血2 h后再灌注后12 h處死大鼠。2-DG的四個劑量組，分別按照 50、100、150、200 mg/kg的劑量進行腹腔注射，每天1次，連續(xù)7 d(將2-DG溶于雙蒸水，工作濃度為50 mg/mL);I/R組和假手術組給予相同體積的雙蒸水替代2-DG腹腔注射，每天1次，連續(xù)7 d。假手術組插入深度少于15 mm。模型成功的標志是術后動物出現(xiàn)同側 Horner＇s征及動物麻醉清醒后出現(xiàn)以左前肢為主的偏癱，評分在1～3分。

1.3 檢測指標

1.3.1 神經(jīng)行為學評分：參考經(jīng)典的 Zea Longa［3］法對大鼠在 MCAO術后清醒后到12 h進行3次神經(jīng)功能評分，取平均值。神經(jīng)功能缺失評分標準為：0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀，活動正常。1分：輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對側前爪。2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，爬行時出現(xiàn)向對側轉(追尾現(xiàn)象)。3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時身體向對側傾斜。4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。

1.3.2 腦組織病理學觀察：造模后再灌注12 h大鼠以10%水合氯醛(0.3 mL/100 mg)腹腔注射麻醉，打開頸部，暴露頸右總動脈，插管，先輸注生理鹽水約50 mL，然后輸注4%多聚甲醛約50 mL，脫頸處死，取腦。甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死中心(即最大層面)，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成4～6 mm厚的切片，附片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，分別觀察梗死中心區(qū)、梗死周邊區(qū)腦組織(海馬CAl區(qū)、CA3區(qū))，前述區(qū)域神經(jīng)細胞和血管內皮細胞(每個觀察區(qū)選擇具有代表性標本觀察結果并記錄)。

1.3.3 大鼠海馬CA1區(qū)葡萄糖調節(jié)蛋白(GRP78)表達的定性測定：造模后12 h，大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后固定，頸正中偏右切口，暴露右頸總動脈，用NS約50 mL灌注，然后用4℃4%多聚甲醛液約50 mL灌注固定，4 h脫頸處死，取腦，取雙側大腦冠狀位距嗅球尖端6～11 mm的腦組織塊，放入4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定24 h，常規(guī)梯度脫水、透明、石蠟包埋。從冠狀面中1/3層面開始留取切片。厚度5 mm，連續(xù)切片，切片貼附于經(jīng)APES處理的載玻片上，備用。用免疫組化法測定。嚴格按試劑盒說明書進行操作。觀察大鼠海馬CA1區(qū)，每張取5個視野數(shù)采用CIAS-1000型圖像分析儀計算GRP78的陽性細胞數(shù)，取其平均值。

1.3.4 大鼠海馬CA1區(qū)GRP78蛋白表達的定量測定：每組動物6只，用10%的水合氯醛按350 mg/kg劑量腹腔注射麻醉動物，脫頸取腦。剪碎腦組織置于裂解液中機械勻漿，4℃ 17 000 r/min離心1 h，取出上清液，棄去沉淀。用考馬斯亮藍G250結合法，根據(jù)已知牛血清白蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計算樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，置于沸水浴中5 min使蛋白變性。制備7.5%分離膠和4%濃縮膠，用微量注射器將樣品加在凝膠表面的樣品槽中。電泳后轉移至硝酸纖維素膜上。5%奶粉TTBS緩沖液振蕩封閉3 h后洗膜，分別加入一抗 GRP78、β-actin，4℃冰箱孵育一夜。洗膜，辣根酶標記羊抗兔IgG HRP，室溫孵育1 h，洗膜后進行ECL(enhanced chemiluminescence)反應1～3 min，暗室曝光Santa Cruz，顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析測定目標帶的DV(integrated density value)，計算出各組目標帶與 β-actin DV比值。

1.3.5 大鼠海馬CA1區(qū)GRP78 mRNA表達的測定：總RNA的提取按Trizol試劑盒說明進行。按試劑盒說明進行反轉錄，擴增體系：10×Taq buffer 2 μL，25 mol/L Mgcl21 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，Taq 酶 0.2 μL，超 純 水12.8 μL。利用引物 5′-ATAATCAGCCCACCGTAA-3′和 5′-CCAATTCATTCCTCGTGT-3′擴 增 330 bp 的GRP78片段，利用引物 5′-CCTAAGGCCAACCGTGAA-3′和 5′-AGCCAGGGCAGTAATCTC-3′擴 增 630 bp的 β-actin。GRP78擴增條件：94℃ 5 min預變性，94℃ 變性 50 s，54℃復性 50 s，72℃ 延伸 50 s，30個循環(huán)，最后經(jīng)72℃延長10 min終止反應。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠神經(jīng)行為學評分

各組大鼠的神經(jīng)行為學評分分別為：假手術組：0.00±0.00，腦缺血再灌注組：(3.33 ±0.52)，2-DG 50、100、150、200 mg/kg 依次為：(2.00 ± 0.63)、(1.33±0.52)、(2.00±0.63)、(2.17±0.75)。與假手術組比較，腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組的神經(jīng)行為學評分具有顯著性差異(P＜0.01);與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組的神經(jīng)行為學評分減低，差異具有顯著性(P＜0.01)，與其他2-DG劑量組比較，100 mg/kg劑量組的神經(jīng)行為學評分最低(P＜0.05)。

2.2 大鼠腦海馬CA1區(qū)組織病理形態(tài)學變化

HE染色(×400)光學顯微鏡下觀察，假手術組見正常神經(jīng)元核圓形，邊界及核仁清楚。腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組均可見正常神經(jīng)元和損傷神經(jīng)元：正常神經(jīng)元核圓形，邊界及核仁清楚;損傷神經(jīng)元胞核腫大，偏位，核仁消失，胞質著色淺、蒼白或核濃縮、深染，細胞呈三角形缺血性壞死變化;損傷神經(jīng)元上述特點在腦缺血再灌注組表現(xiàn)得更明顯。與假手術組比較，腦缺血再灌注組和2-DG組可見損傷細胞數(shù)目增多，與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組能不同程度的改善神經(jīng)細胞的核深染、核固縮程度，減少細胞及間質的水腫，使胞膜清楚，形態(tài)正常，核仁清晰可見的神經(jīng)細胞數(shù)目增多;與2-DG的其他劑量組相比較，2-DG 100 mg/kg組改善神經(jīng)細胞的核深染、核固縮程度更加明顯，細胞及間質的水腫明顯減輕，胞膜清楚，形態(tài)正常，核仁清晰可見的神經(jīng)細胞數(shù)目增多。見圖1(彩插8)。

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)GRP78蛋白的陽性表達

與假手術組比較，腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組的GRP78蛋白表達差異具有顯著性(P＜0.01);與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組的GRP78蛋白表達差異均具有顯著性(P＜0.01)，而以100 mg/kg劑量組最為明顯(P＜0.05)見表1。

2.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)GRP78蛋白的定量表達

與假手術組相比，腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組GRP78蛋白表達均增高，差異有顯著性(P＜0.01);與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組更為明顯(P＜0.01)，而 2-DG 100 mg/kg組 GRP78蛋白表達最高(P＜0.05)。見圖2和表1。

圖2 GRP78蛋白的檢測結果Fig.2 The results of GRP78 protein detection

2.5 各組大鼠海馬CA1區(qū)GRP78 mRNA的表達

與假手術組比較，腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組GRP78mRNA表達差異有顯著性(P＜0.01)，與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組差異有顯著性(P＜0.01)，而2-DG 100 mg/kg組 GRP78 mRNA表達最高，與其他2-DG各劑量組比較差異具有顯著性(P＜0.05)。見圖3和表1。

圖3 GRP78mRNA檢測結果Fig.3 The results of GRP78 mRNA detection

表1 2-DG對腦缺血再灌注大鼠缺血側海馬CA1區(qū)GRP78陽性細胞表達的影響Tab.1 The effect of 2-DG on GRP78-expression positive cells in the ischemic hippocampal CA1 area at the ischemic side

3 討論

預處理(preconditioning，PC)是指在嚴重缺血之前給予的各種保護性的/干預性措施，包括缺血預處理(ischemic preconditioning，IP)、升高體溫、藥物干預、高壓氧等，其中IP是常用方法。IP是指對腦預先進行一次或多次短暫的非致死性缺血刺激后，機體獲得對更嚴重甚至致死性腦缺血的耐受性，表現(xiàn)為腦細胞死亡明顯減少，梗死范圍大幅縮小、器官功能障礙明顯減輕等。這種IP誘導腦組織對隨后的腦缺血性損傷產生遲發(fā)性的抵抗能力的現(xiàn)象稱為腦缺血耐受［5-8］

預處理是目前細胞保護的一大策略［7］，主要涉及缺血預處理、藥物預處理和低氧預處理等。鑒于輕度的ERS可促進內質網(wǎng)對蓄積在網(wǎng)腔內的錯誤折疊或未折疊蛋白的處理，有利于維持細胞的正常功能并使之存活［9］，提示ERS預處理可以作為一種細胞保護的新策略，在 ERS相關疾病中發(fā)揮重要作用。

2-DG是一種常見的不可代謝的葡萄糖衍生物，動物實驗發(fā)現(xiàn)2-DG能誘導GRP78的表達上調，抑制癲癇發(fā)作，而且沒有觀察到任何的副作用［10，11］。它可以迅速進入腦通過己糖激酶途徑后以較為穩(wěn)定的6-磷酸-2-DG的形式積累，后者可以抑制腦細胞內糖的氧化［12］;同時 6-磷酸-2-DG 很難被代謝，可持續(xù)性抑制葡萄糖，干擾蛋白質的糖基化［13］。糖基化是內質網(wǎng)內新蛋白合成和分泌的關鍵步驟，其過程受阻導致未折疊和錯折疊蛋白在內質網(wǎng)腔內積累，觸發(fā)ERS，是ERS的誘導劑，但其最佳劑量還未確定。

GRP78在ERS時表達異常增高，可以看作ERS的標志性蛋白［14］，可促進內質網(wǎng)中未折疊蛋白正確折疊、修飾，具有保護內質網(wǎng)功能的作用。GRP78還具有維持細胞內鈣平衡的作用［15］。因此，GRP78在應激條件下對細胞起保護作用。

從本實驗結果可以發(fā)現(xiàn)，與腦缺血再灌注組相比，2-DG各劑量組大鼠的神經(jīng)行為學評分明顯減低(P＜0.01)，而以100 mg/kg組評分減低最為明顯(P＜0.05);同時亦發(fā)現(xiàn)，2-DG各劑量組能不同程度的改善大鼠腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的核深染、核固縮程度，減少細胞及間質的水腫，使胞膜趨于清楚、形態(tài)接近正常、核仁清晰可見的神經(jīng)細胞數(shù)目增多，而以2-DG 100 mg/kg組的效果最為明顯。提示2-DG對腦缺血再灌注所致的神經(jīng)細胞損傷具有保護作用，其最佳劑量為100 mg/kg。

研究發(fā)現(xiàn)，作為內質網(wǎng)應激標志物的分子伴侶GRP78可促進內質網(wǎng)中未折疊蛋白正確折疊、修飾，具有保護內質網(wǎng)功能的作用，在 ERS時表達上調，可以看作 ERS的標志性蛋白［16，17］。本實驗結果顯示，2-DG各劑量組GRP78蛋白表達明顯增加，與腦缺血再灌注組比較，差異有顯著性(P＜0.01)，提示神經(jīng)元發(fā)生了 ERS;而以100 mg/kg劑量組的GRP78蛋白表達最高，與其他2-DG劑量組比較差異有顯著性(P＜0.05)。提示2-DG具有誘導大鼠內質網(wǎng)應激的作用，其最佳劑量是100 mg/kg。

(本文圖1見彩插8。)

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Optimization of the dosage of 2-deoxy-glucose in the establishment of a mouse model of endoplasmic reticulum stress

ZHANG Chun-xue1，MIN He-ming2，MIN Lian-qiu1
(1.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China;2.College of Basic Medicine，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

Objective To explore the optimal dosage of 2-deoxy-glucose(2-DG)in the establishment of a mouse model of endoplasmic reticulum stress.Methodes 108 healthy male SD rats were choosen and randomly divided into 6 groups： sham-operation group，ischemia-reperfusion group，2-DG 50 mg/kg group，2-DG 100 mg/kg group，2-DG 150 mg/kg group，2-DG 200 mg/kg group，using different dosage of 2-DG to set up models of endoplasmic reticulum stress.2-DG was dissolved in double distilled water on working concentration of 50 mg/mL and injected into the rat abdomen for 7 days.The sham-operation and ischemia-reperfusion groups were injected with distilled water instead of 2-DG.After ischemia-reperfusion for 12 h，the rats were killed and the neurological function of each group was evaluated and，the pathological changes were observed with HE staining，and the expression of GRP78 was detected by immunohistochemistry and Western blot.The expression of GRP78 mRNA was detected by RT-PCR.Results The scores of 2-DG groups were significantly decreased compared with that in the sham-operation and ischemia-reperfusion group(P＜0.01)，and that of the 2-DG 100 mg/kg group decreased more obviously(P ＜0.05).The 2-DG treatment improved the nerve cell damage，depicting cell membranes more clearly，forming normal cell appearance，and increased number of visible nucleoli in neurons.The improvement in the 2-DG 100 mg/kg group was most significant.The expression of GRP78 was significantly increased in 2-DG groups in comparison with the ischemia-reperfusion group(P ＜0.01).Furthermore，the expression of GRP78 protein in the 2-DG100 mg/kg group was most increased compared with that in other 2-DG groups.Conclusions 2-DG has protective effect on cerebral ischemia-injured neurons and can induce endoplasmic reticulum stress in rat brain at the best dose of 100 mg/kg.

2-deoxyglucose;Endoplasmic reticulum stress;Rats;Animal model

Q95-33，R-33

A

1005-4847(2011)01-0074-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.017

遼寧省自然科學基金項目(No.20092192)。

張春雪，女，碩士研究生，E-Mail：zhangchunxue@yahoo.com.cn。

閔連秋，男，教授，主任醫(yī)師。研究方向：腦血管疾病的基礎與臨床。E-mail：minlianqiu@163.com。

2010-09-25