朱 亮，蔡月琴，屠 玨，應(yīng)華忠，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053)

應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記研究Dunkin Hartley豚鼠封閉群的遺傳背景

朱 亮，蔡月琴，屠 玨，應(yīng)華忠，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053)

目的 檢測(cè)我國現(xiàn)有Dunkin Hartley豚鼠封閉的遺傳背景，分析評(píng)估其遺傳多樣性水平和遺傳分離情況，為建立標(biāo)準(zhǔn)化的豚鼠封閉群監(jiān)測(cè)方法提供基礎(chǔ)資料。方法 應(yīng)用篩選獲得的8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，從一個(gè)數(shù)量為1000的豚鼠封閉群中隨機(jī)選擇72個(gè)個(gè)體，通過PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，進(jìn)行等位基因檢測(cè)。并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析評(píng)估了該豚鼠封閉群的遺傳現(xiàn)狀。結(jié)果 共檢測(cè)到28個(gè)等位基因，每個(gè)座位的等位基因數(shù)為2～5個(gè)，有效等位基因數(shù)為1.5191～3.4422，平均2.3093。平均期望雜合度為0.5294。各位點(diǎn)多態(tài)信息含量在0.3154～0.6545之間，平均值為0.4687。有5個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。結(jié)論 豚鼠封閉群的遺傳多態(tài)性處于中等水平，遺傳平衡檢測(cè)結(jié)果提示種群的繁殖過程未能實(shí)現(xiàn)完全隨機(jī)交配，近交現(xiàn)象一定程度上存在。本研究的結(jié)果將為豚鼠封閉群遺傳監(jiān)測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)。

豚鼠;封閉群;微衛(wèi)星標(biāo)記;遺傳多樣性

浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心豚鼠繁殖中心于1998年引進(jìn)Dunkin Hartley豚鼠封閉群，飼養(yǎng)保種至今，已形成1000個(gè)個(gè)體的種群。中心研究人員通過磁珠富集法篩選獲得了17個(gè)豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)［1］。本研究將以這些位點(diǎn)為工具，對(duì)Dunkin Hartley豚鼠封閉群進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)，以期獲得現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)豚鼠種群的遺傳概貌信息，并從分子遺傳角度對(duì)現(xiàn)有繁育方式做出評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑和儀器

Dunkin Hartley豚鼠72只，從浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心豚鼠繁殖中心飼養(yǎng)的封閉群中隨機(jī)抽?。跾CXK(浙)2008-0037］。PCR相關(guān)試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。聚丙烯酰胺凝膠電泳相關(guān)試劑購自上海生工生物工程有限公司。PTC-200 PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad);水平電泳系統(tǒng)和垂直電泳系統(tǒng)(GE);凝膠成像系統(tǒng)(UVP)。

1.2 基因組的提取

取豚鼠新鮮肌肉組織(0.3～0.5)cm3，在 1.5 mL離心管中用消毒后的剪刀剪成小碎塊。然后參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》方法提取基因組DNA［2］。

1.3 引物的選擇及篩選

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，從已有的17個(gè)豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出8個(gè)多態(tài)性好的位點(diǎn)(表1)進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。所有引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增

10 μL 反應(yīng)體系：1 μL 模板 DNA(10 ～30 ng)，0.5 U Taq DNA 聚合酶，1 μL 10×PCR 緩沖液，1 μL MgCl2(25 mmol/L) ，0.75 μL dNTPs(20 mmol/L)，上下游引物(10 μmol/L)各 0.1 μL。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，每對(duì)引物的最佳退火溫度(表 1)退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);然后72℃延伸10 min。

1.5 等位基因的分離

從擴(kuò)增產(chǎn)物中取2 μL在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整產(chǎn)物濃度。利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等位基因分離。電泳條件：恒壓250 V，0.5×TBE緩沖液中電泳3～4 h。經(jīng) Gelred染色，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。然后對(duì)等位基因電泳圖譜進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在 Cervus 3.0遺傳分析軟件上［3］，根據(jù) Bostein等的公式［4］，計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC); 根 據(jù)Chakraborty的公式，分別計(jì)算單位點(diǎn)非父排除概率(exclusion probability，PE)和多位點(diǎn)非父累積排除概率 (cumulative exclusion probability，CPE)。根 據(jù)Fisher的公式［5］：DPi=1 －，計(jì)算單位點(diǎn)個(gè)體識(shí)別率(discrimination power，DP)，n表示某位點(diǎn)的基因型數(shù)，Pi表示該位點(diǎn)第i個(gè)基因型的頻率;根據(jù)公式：CDP=1－(1－DPi)，計(jì)算多位點(diǎn)累積個(gè)體識(shí)別率(cumulative DP)，其中，m表示微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)，DPi表示第 i個(gè)位點(diǎn)的個(gè)體識(shí)別率。評(píng)估本研究使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)的質(zhì)量及其反映群體遺傳水平的有效性。

使用 POPGENE version 1.32 軟件［6］統(tǒng)計(jì)計(jì)算各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在豚鼠群體中的觀察等位基因數(shù)(number of alleles per locus，Na)、有效等位基因數(shù)(number of effective alleles，Ne)、觀察雜合度 (observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)等指標(biāo)。從而評(píng)估各微衛(wèi)星位點(diǎn)及豚鼠群體的遺傳多樣性。

使用GENEPOP軟件對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，根據(jù)位點(diǎn)等位基因的數(shù)目多少，應(yīng)用完全計(jì)數(shù)或馬爾科夫鏈法檢驗(yàn)群體的Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)，同時(shí)計(jì)算Fis值用于評(píng)估群體的近交程度。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均呈現(xiàn)出多態(tài)性，共檢測(cè)到28個(gè)等位基因，各等位基因片段大小在149～349 bp之間。每個(gè)座位的等位基因數(shù)在2～5個(gè)之間，平均等位基因數(shù)3.5個(gè)。各基因位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)為1.5191～3.4422不等，平均為2.3093個(gè)。等位基因最多的座位是 Cpo8，有5個(gè)等位基因;等位基因最少的座位是Cpo6，有2個(gè)等位基因?；蛐头N類最多的位點(diǎn)是 Cpo8，檢測(cè)到9種基因型;位點(diǎn)Cpo6顯示的基因型只有2種，是所有位點(diǎn)中最少的。各個(gè)基因位點(diǎn)的等位基因數(shù)、等位基因頻率和有效等位基因數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

2.2 群體遺傳多樣性分析

利用POPGENE version 1.32計(jì)算出各座位的觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量等指標(biāo)，評(píng)估位點(diǎn)及群體的遺傳多樣性，結(jié)果見表3。各個(gè)基因位點(diǎn)的觀察雜合度在0.2222～0.5833之間，群體平均值為0.4531;期望雜合度在0.3441～0.7159之間，群體平均值為0.5294;8個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量數(shù)值在0.3154～0.6545之間波動(dòng)，群體平均值為0.4687。期望雜合度和多態(tài)信息含量最低的座位是Cpo3，分別為0.3441和0.3154;最高的座位是 Cpo11，分別為0.7159和0.6545。這8個(gè)位點(diǎn)的個(gè)體識(shí)別率從0.5403至0.8606不等，累積個(gè)體識(shí)別率達(dá)到了1.0000;各位點(diǎn)非父排除概率1在0.0584～0.2833之間，八位點(diǎn)累積值為0.7570;各位點(diǎn)非父排除概率2在0.1728～0.4519之間，八位點(diǎn)累積值為0.9415。

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

采用 Fisher＇s 精確檢驗(yàn)(Fisher＇s exact test)或馬可夫鏈模型計(jì)算豚鼠群體每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的精確 P值，并計(jì)算相應(yīng)的Fis值［Fis(W＆C)］。結(jié)果顯示(表 3)，在本研究檢測(cè)的一共 8個(gè)位點(diǎn)中，有 5個(gè)位點(diǎn)(Cpo2、Cpo4、Cpo6、Cpo8、Cpo11)顯著偏離了 Hardy-Weinberg 平衡。在5個(gè)偏離 Hardy-Weinberg平衡的位點(diǎn)中，有4 個(gè)位點(diǎn)(Cpo2、Cpo4、Cpo8、Cpo11)的 Fis值為正值。以上結(jié)果提示本研究檢驗(yàn)的豚鼠群體存在雜合子缺失的現(xiàn)象。

表1 8個(gè)豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)和相關(guān)信息Tab.1 Charecteristics of eight microsatellite loci from guinea pig(Cavia porcellus)

表2 豚鼠封閉群在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因信息Tab.2 Allele information at 8 microsatellite loci of guinea pig outbred colony

表3 豚鼠封閉群在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的遺傳多態(tài)性Tab.3 The genetic diversity measured at 8 microsatellite loci of guinea pig outbred colony

3 討論

3.1 微衛(wèi)星標(biāo)記在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群遺傳檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值

作為一大類常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，封閉群動(dòng)物在遺傳學(xué)上有顯著的特點(diǎn)。封閉群個(gè)體的遺傳結(jié)構(gòu)呈雜合性，在同一基因位點(diǎn)上包含更多的等位基因，即具有更高的基因多態(tài)性。封閉群動(dòng)物的遺傳背景一般通過等位基因個(gè)數(shù)、等位基因頻率和基因型頻率來體現(xiàn)。要獲得以上參數(shù)的準(zhǔn)確數(shù)值，需要一個(gè)合適的遺傳檢測(cè)工具。該遺傳檢測(cè)工具要能夠檢測(cè)多位點(diǎn)并體現(xiàn)各位點(diǎn)的高多態(tài)性。而目前常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)方法是以生化標(biāo)記檢測(cè)為主的表型檢測(cè)方法，主要針對(duì)近交系動(dòng)物。其檢測(cè)位點(diǎn)較少體現(xiàn)多態(tài)性差，不適合于遺傳多態(tài)性高的封閉群動(dòng)物，無法反映封閉群動(dòng)物種群真實(shí)的遺傳概貌。而微衛(wèi)星標(biāo)記具有以下特點(diǎn)：①分布廣，覆蓋整個(gè)基因組;②數(shù)量多，揭示的多態(tài)性高;③呈現(xiàn)多等位基因的特性，提供的信息量大;④引物通用、容易擴(kuò)增。以上特點(diǎn)使微衛(wèi)星標(biāo)記很適合用于封閉群動(dòng)物的遺傳檢測(cè)。

本研究利用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，采用PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳分型技術(shù)對(duì)一個(gè)Dunkin Hartley豚鼠封閉群的遺傳背景進(jìn)行了檢測(cè)。涉及的8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)從0.3154至0.6545不等。多態(tài)信息含量(PIC)是根據(jù) Botstein et al(1980)提出的公式計(jì)算出來的，它是衡量微衛(wèi)星DNA座位變異程度高低的指標(biāo)。當(dāng)微衛(wèi)星座位的PIC＞0.5時(shí)，為高度多態(tài)座位;當(dāng)0.5＞PIC＞0.25時(shí)，為中度多態(tài)座位;當(dāng)PIC＜0.25時(shí)，為低度多態(tài)座位。本研究涉及的8個(gè)豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)中，3個(gè)為高度多態(tài)位點(diǎn)，5個(gè)為中度多態(tài)位點(diǎn)，平均多態(tài)信息含量為0.467。同時(shí)，這8個(gè)位點(diǎn)的個(gè)體識(shí)別率從0.5403至0.8606不等，累積個(gè)體識(shí)別率達(dá)到了1.0000;其累積非父排除概率1和累積非父排除概率2分別達(dá)到了0.7570和0.9415。以上結(jié)果表明本研究使用的8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)能夠提供充足的遺傳多樣性信息，可以滿足封閉群動(dòng)物遺傳背景檢測(cè)的要求，同時(shí)還可以作為動(dòng)物個(gè)體間親緣關(guān)系檢測(cè)及新品系培育等工作的有力輔助工具。

3.2 豚鼠封閉群的遺傳多樣性

每個(gè)位點(diǎn)等位基因的數(shù)目及全部位點(diǎn)等位基因的平均數(shù)是表征遺傳多態(tài)性的重要參數(shù)。有效等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù)，反映了等位基因的相互影響，也可作為群體遺傳變異的一個(gè)指標(biāo)［7］。本研究各座位等位基因數(shù)在2～5個(gè)之間，平均3.5個(gè)，各位點(diǎn)有效等位基因平均2.3093。

觀察雜合度和期望雜合度都是群體遺傳多樣性的反映。前者反映的是群體中實(shí)際的雜合比例，容易受樣本大小等因素的影響。而期望雜合度是假定各基因座位符合Hardy-Weinberg平衡而得到的雜合度，它受樣本取樣的影響較小，常被用來度量群體的遺傳多樣性，其高低可反映群體的遺傳一致性程度［7］，期望雜合度的數(shù)值越高，所在群體的遺傳多樣性就越豐富。本研究中各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)期望雜合度在0.3441～0.7159之間，群體平均值為0.5294。

由于豚鼠種群的遺傳多樣性水平目前還沒有報(bào)道，我們將本研究獲得的豚鼠種群遺傳多樣性指標(biāo)與分類地位相近的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做了比較。昆明小鼠封閉群的平均等位基因數(shù)為6.1333，平均有效等位基因數(shù)為 3.1029，平均期望雜合度為 0.5721［8］;Wistar大鼠和SD大鼠的平均等位基因數(shù)為4.1667和4.3333，平均有效等位基因數(shù)為2.6717和2.5629，平均期望雜合度為 0.5982和 0.5859［9］;長(zhǎng)爪沙鼠的平均等位基因數(shù)為2.6，平均有效等位基因數(shù)為2.1756［10］。日本大耳白兔、新西蘭兔和 WHBE兔的平均有效等位基因數(shù)分別為3.6077、2.6537和2.0402［11］。通過比較可見，本研究中 的 Dunkin Hartley豚鼠種群遺傳多樣性處于中等水平。

Fis是種群內(nèi)個(gè)體之間的近交系數(shù)，它的取值范圍為-1至1。當(dāng)Fis值為極顯著的正值時(shí)，表示群體內(nèi)近交程度較嚴(yán)重;當(dāng)Fis值為極顯著的負(fù)值時(shí)，群體內(nèi)觀測(cè)雜合度大于期望雜合度，則表示群體內(nèi)存在遠(yuǎn)交［12］。本研究得到的 Fis值在 4個(gè)位點(diǎn)(Cpo2、Cpo4、Cpo8、Cpo11)為正值，說明該豚鼠種群內(nèi)雜合體較少，提示群體內(nèi)存在近交現(xiàn)象。

根據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果，豚鼠種群在 5 個(gè)位點(diǎn)(Cpo2、Cpo4、Cpo6、Cpo8、Cpo11)偏離Hardy-Weinberg平衡，在3個(gè)位點(diǎn)處于遺傳平衡狀態(tài)(Cpo3、Cpo13、Cpo14)，大部分偏離遺傳平衡的位點(diǎn)都表現(xiàn)出雜合子缺失的現(xiàn)象。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因除了無效等位基因之外，大部分的偏離可能是封閉群內(nèi)存在近交導(dǎo)致的。同時(shí)，偏離遺傳平衡的位點(diǎn)相應(yīng)的Fis值絕大多數(shù)為正值，也揭示了種群內(nèi)存在一定程度近交的可能性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群Hardy-Weinberg平衡偏離現(xiàn)象在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育研究中常見報(bào)道的一個(gè)問題［13，14］。

封閉群動(dòng)物個(gè)體的遺傳結(jié)構(gòu)呈雜合性，而整個(gè)動(dòng)物群體內(nèi)全部雜合型基因的分布頻率，即遺傳組成在每一代保持穩(wěn)定性。雜合性有利于群體攜帶更多的基因，穩(wěn)定性則保證群體對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)呈現(xiàn)最大的重復(fù)性［15］。如果隨機(jī)交配因素在種群內(nèi)持續(xù)存在的話，會(huì)導(dǎo)致等位基因的丟失和種群基因頻率的改變，無法保持封閉群的遺傳特性，從而影響到試驗(yàn)結(jié)果的可比性。以目前封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的繁育過程中普遍缺乏相應(yīng)的遺傳監(jiān)測(cè)的現(xiàn)狀來看，除了要遵守嚴(yán)格的繁育程序操作以避免近交現(xiàn)象，還有必要對(duì)封閉群進(jìn)行定期的遺傳檢測(cè)，并且根據(jù)檢測(cè)結(jié)果評(píng)估和調(diào)整繁育方式。

本研究利用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，初步確定了豚鼠群體的遺傳概貌，揭示了豚鼠封閉種群的遺傳多樣性處于中等水平。同時(shí)，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果提示種群的繁殖過程未能實(shí)現(xiàn)完全隨機(jī)交配，近交現(xiàn)象一定程度上存在。本研究的結(jié)果將為豚鼠封閉群遺傳監(jiān)測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)。

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Assessment of the genetic background in Dunkin Hartley guinea pig outbred stock using microsatellite DNA markers

ZHU Liang，CAI Yue-qin，TU Jue，YING Hua-zhong，XU Jian-qin，CHEN Min-li
(Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China)

Objective To estimate the genetic diversity and genetic differentiation of a Dunkin Hartley guinea pig outbred stock and providing valuable information and references for standardization of the population.Methods A total of 72 samples from a Dunkin Hartley guinea outbred pig stock were genotyped using 8 microsatellite DNA markers by PCR-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.Genetic variation of the population was evaluated and Hardy-Weinberg equilibrium was tested for each locus.Results 28 alleles were found in the outbred stock，2-5 alleles each locus，and the effective number of alleles each locus ranged from 1.5191 to 3.4422，with an average of 2.3093.The average of unbiased expected heterozygosity was 0.5294.The polymorphic information content(PIC)ranged from 0.3154 to 0.6545，with an average of 0.4687.Five of 8 loci showed significant deviations from Hardy-Weinberg equilibrium(HWE).Conclusions The results indicate that the genetic diversity of the Dunkin Hartley guinea pig outbred stock is moderate.Inbreeding has some shortcomings in comparison with outbred stock.Genetic information provided by this reserch will be useful in developing genetic monitoring methods and standardization of the outbred guinea pigs.

Guinea pig;Outbred colony;Microsatellite mark;Genetic diversity

Q95-33，R394

A

1005-4847(2011)01-0051-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.012

豚鼠作為一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被用于生物醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史。目前，在速發(fā)型過敏性呼吸道疾病研究、各種抗結(jié)核病藥物的篩選、實(shí)驗(yàn)性壞血病研究、聽覺和內(nèi)耳疾病研究等方面，豚鼠都是最佳選擇。

Dunkin Hartley豚鼠是英國種豚鼠的白化封閉群，因?yàn)槠渖L(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)，繁殖性能好，是我國使用最廣泛的封閉群豚鼠。

浙江省科技廳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(2008F80024)。

朱亮(1978-)，女，助理研究員，博士，研究方向：動(dòng)物分子遺傳。E-mail：tozhuliang@126.com

2010-09-30