李 德，唐 兵，楊大春，馬雙陶，楊永健

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，成都 610083)

Ⅱ型膠原酶加壓灌流提高成年大鼠心肌細胞分離效率

李 德，唐 兵，楊大春，馬雙陶，楊永健

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，成都 610083)

目的 探討效率更高的成熟心肌細胞分離方法。方法 采用Ⅱ型膠原酶升主動脈逆行灌流法分離成年大鼠心肌細胞。對照組采用Langendorff裝置灌流;實驗組在Langendorff裝置基礎上加壓勻速灌流。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并計算桿狀細胞比率及產(chǎn)量;通過臺盼藍染色和局部場剌激評價心肌細胞活性。結果 分離即刻，實驗組桿狀細胞比率顯著高于對照組【(90.3±4.4)% νs.(53.4±5.2)%，P＜0.01】;實驗組活細胞產(chǎn)量也顯著高于對照組［(3.6±0.7) ×107νs.(1.9±0.6) ×107，P＜0.01］。復鈣過程中，實驗組發(fā)生自發(fā)性收縮的細胞比率及變圓細胞比率均明顯低于對照組【(10.4±2.1)% νs.(18.9±4.5)%，P＜0.01;(5.3±1.3)% νs.(8.6±1.7)%，P＜0.05】。實驗組臺盼藍染色陰性的桿狀細胞比率和局部場剌激條件下收縮細胞比率明顯高于對照組【(95.3±8.2)% νs.(90.6±9.8)%，P＜0.05;(92.2±7.6)% νs.(85±6.4)%，P＜0.01】。結論 Ⅱ型膠原酶加壓灌流可獲得高產(chǎn)量、高活性的心肌細胞，提高了成熟心肌細胞的分離效率。

大鼠;心肌細胞;細胞分離

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，8～10周齡，體質(zhì)量200～250 g，來源于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心【SCXK(渝)2007-0003】，所有實驗嚴格按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。實驗分組：對照組和實驗組，每組各10只大鼠。

1.2 試劑

II型膠原酶購自 Sigma公司(美國);HEPES、牛血清白蛋白(BSA)購自Gibco公司(美國);其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要液體配制

1.3.1 無鈣臺氏液配方 (mmol/L)：NaC1 36、KCl 5.4、NaH2PO40.33、MgC12·6 H2O 1.0、葡萄糖 10、HEPES 10，以 NaOH調(diào)整 pH=7.4。

1.3.2 0.05% Ⅱ型膠原酶：15 mgⅡ型膠原酶、30 mg BSA，溶于300 mL無鈣臺氏液。

1.3.3 KB 液配方(mmol/L)：KOH 20、谷氨酸鉀 50、KCl 40、牛黃酸20、KH2PO420、MgC12·6 H2O 3、HEPES 10、葡萄糖 10、EGTA 0.5，以 KOH 調(diào)整 pH=7.4。

1.3.4 復鈣用無鈣臺氏液：每100 mL無鈣臺氏液中加入牛黃酸0.25 g、BSA 50 mg;180 mmol CaCl2貯存液：1.998 g無水CaCl2溶于100 mL三蒸水。

1.3.5 1.8 mmol CaCl2臺氏液：復鈣用無鈣臺氏液9.9 mL加入 180 mmol CaCl2貯存液 100 μL。

1.3.6 0.18 mmol CaCl2臺氏液：復鈣用無鈣臺氏液9 mL加入1.8 mmol CaCl2鈣臺氏液1 mL。所有液體均用0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.4 心肌細胞的分離

整個操作過程在超凈臺中進行。Langendorff裝置各部件高溫、高壓滅菌，連接管用環(huán)氧乙烷消毒。適當設置Langendorff溫度，使終端灌流液的溫度保持在37℃。兩灌流瓶中分別預充無鈣臺氏液和0.05%II型膠原酶。灌流前灌流液預充混合氣體(95%O2和5%CO2)15 min，并且整個灌流過程中持續(xù)充氣。SD大鼠腹腔注射戊巴妥鈉(35 mg/kg)和肝素液1 mL(1000 U/mL)。麻醉顯效后，仰臥位固定于蛙板，75%酒精消毒胸腹部皮膚?！癠”形剪開皮膚及胸壁暴露縱隔，于降主動脈段快速離斷主動脈，取出心臟，置于4℃無鈣臺氏液，輕輕擠出心腔內(nèi)血液，將心臟懸掛于灌流裝置，經(jīng)升主動脈逆行灌注無鈣臺氏液和膠原酶消化液。對照組采用Langendorff裝置灌流(圖1)。先以無鈣臺氏液灌流5 min，沖洗冠脈中的殘留血液，并且解離心肌細胞之間Ca2+依賴的緊密連接，然后用0.05%II型膠原酶循環(huán)灌流20 min或直到心臟明顯變軟、略帶微黃(圖2)。實驗組在改良Langendorff裝置基礎上用注射器輔助加壓勻速灌流(圖3)，流量25 mL/min，其余操作同對照組。剪下心室組織置于KB液中，撕去心外膜，用眼科鑷將心肌撕成小塊。轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，用吸管輕輕吹打數(shù)次。200目濾網(wǎng)過濾后室溫靜置10 min，去上清。圖1～3見封三。

1.5 心肌細胞梯度復鈣

加入0.18 mmol CaCl2臺氏液10 mL重懸細胞，靜置10 min，細胞自然沉降;吸除上清5 mL，再加入1.8 mmol CaCl2臺氏液 5 mL重懸細胞，靜置 10 min，細胞自然沉降，去上清;加入1.8 mmol CaCl2臺氏液10 mL重懸細胞，靜置10 min，細胞自然沉降。

1.6 心肌細胞產(chǎn)量及活性檢測

1.6.1 計數(shù)：在倒置顯微鏡下用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，計算每個心臟細胞產(chǎn)量。細胞數(shù)/毫升原液=(4個大格細胞數(shù)之和/4)×104×稀釋倍數(shù)。

1.6.2 臺盼藍染色：用0.4%臺盼藍染色，臺盼藍拒染的細胞為活的心肌細胞，計算臺盼藍染色陰性的桿狀(包括矩形)細胞占總桿狀細胞數(shù)的百分比。

1.6.3 場剌激觀察收縮細胞比率：將心肌細胞加入檢測皿，給予局部場刺激(頻率1 Hz，電壓15 V，脈寬2 ms)，在倒置顯微鏡下計算收縮細胞比率。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 心肌細胞的形態(tài)及產(chǎn)量

在倒置顯微鏡下觀察，分離即刻的心肌細胞主要有4種形態(tài)：呈桿狀、矩形、圓形和團塊狀。高倍鏡下，桿狀和矩形細胞橫紋清晰、棱角分明，為存活的心肌細胞;圓形和團塊狀細胞胞膜皺縮，無橫紋，為死細胞或受損細胞(圖4，封三)。實驗組桿狀(包括矩形)細胞比率顯著高于對照組(90.3±4.4)% νs.(53.4±5.2)%，P＜0.01;實驗組活細胞產(chǎn)量也顯著高于對照組(3.6±0.7) × 107νs.(1.9±0.6) × 107，P＜0.01。培養(yǎng)48 h后心肌細胞發(fā)生形態(tài)變化，由桿狀變成扁平狀，棱角逐漸變得圓鈍(圖5，封三)。

2.2 心肌細胞活性(表1)

在復鈣的過程中部分桿狀和矩形細胞出現(xiàn)自發(fā)性收縮，少部分變圓，實驗組發(fā)生自發(fā)性收縮的細胞比率及變圓細胞比率均明顯低于對照組;被臺酚藍染色的細胞為死亡細胞，臺盼藍拒染的細胞為活的心肌細胞，實驗組臺盼藍染色陰性的桿狀(包括矩形)細胞比率明顯高于對照組;局部場刺激可檢測心肌細胞的收縮活性，實驗組收縮細胞比率顯著高 于對照組。

表1 兩組心肌細胞活性比較(n=10)Tab.1 Comparison of the viability of cardiomyocytes in the two groups

3 討論

建立穩(wěn)定的心肌細胞分離方法、獲得高質(zhì)量的心肌細胞是成熟心室肌細胞培養(yǎng)成功的關鍵。目前成年心肌細胞的分離主要有2種方法，即離體心臟灌注消化法和心肌組織浸泡消化法［4］。離體心臟生物酶灌注消化法分離心肌細胞效果較好，分離出的成熟心肌細胞具有活性高、數(shù)量多等優(yōu)點，但對實驗條件和實驗技術要求較高。

由于心肌細胞分離過程復雜、環(huán)節(jié)較多，傳統(tǒng)的Langendorff裝置不方便消毒滅菌，容易造成分離細胞的污染。我們將 Langendorff裝置設計制作成幾個可拆卸部分，以方便高溫、高壓消毒，使用前在超凈臺中進行組裝。心肌細胞分離的所有操作均可在超凈臺中完成，大大降低了微生物污染的可能性。但是，超凈臺內(nèi)高度有限，導致灌注壓不足，影響了心肌細胞分離效果。而且，隨著灌流瓶中液面的下降，灌注壓進一步降低，整個消化過程中消化液流量極不穩(wěn)定。消化的不同階段對灌流速度也有明顯影響。開始數(shù)分鐘流速較快;消化中期消化液會變得很黏稠，流速變慢;末期因血管被消化，流速加快。實驗過程中我們觀察到，上述因素引起的灌流不暢明顯影響心肌細胞分離效果。本研究采用II型膠原酶加壓勻速灌流，每只大鼠心臟的細胞產(chǎn)量可達3.6×107，桿狀和矩形細胞比率達90%以上，顯著高于對照組，明顯提高了成熟心肌細胞的分離效果。

成年大鼠心肌細胞個體大而脆弱，消化過程中的很多因素很容易引起心肌細胞的損傷，最終影響細胞的活性［5，6，7］。復鈣時出現(xiàn)自發(fā)性收縮及變圓的細胞為“鈣反?！奔毎?，提示在分離過程中細胞膜受到損傷?；钚约毎募毎ね暾?，所以臺盼藍不能進入細胞內(nèi)而拒染。死亡或損傷嚴重的心肌細胞膜缺乏完整性，被臺盼藍染成藍色。本研究實驗組自發(fā)收縮細胞比率和變圓細胞比率均明顯低于對照組，而臺盼藍染色陰性細胞比率顯著高于對照組，表明Ⅱ型膠原酶加壓勻速灌流可有效減少心肌細胞損傷。收縮活性是成熟心肌細胞功能的特征性標志。場剌激研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型膠原酶加壓勻速灌流所獲得的心肌細胞中收縮細胞比率顯著高于對照組，表明實驗組心肌細胞的功能活性也得到了較好的保護。

在心肌細胞培養(yǎng)過程中，除了要警惕成纖維細胞的污染外，還必須關注心肌微血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的存在。內(nèi)皮細胞在鏡下可成“鋪路石”樣改變，與心肌細胞大相徑庭，而血管平滑肌細胞在鏡下成梭狀，但一般不會發(fā)生心肌細胞特異性的“搏動”現(xiàn)象，可據(jù)此鑒別兩者。心肌微血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞往往需要過度消化才會出現(xiàn)在培養(yǎng)細胞中，故如發(fā)現(xiàn)有以上兩者的污染，則應縮短消化時間。另外，心肌細胞較大，沉降較快，分離的心肌細胞置于KB液中進行反復沉降，可有效去除細胞碎片和雜細胞，得到比較純凈的心肌細胞。

本研究采用改良Langendorff裝置進行Ⅱ型膠原酶加壓勻速灌流，分離成熟心肌細胞，不但滿足了細胞培養(yǎng)的無菌要求，而且提高了成熟心肌細胞的分離效率，獲得了高產(chǎn)量、高活性的心肌細胞，為成熟心肌細胞培養(yǎng)及研究奠定了基礎。

(本文圖1～5見封三。)

［1］ 王亭忠，席雨濤，吳格如，等.大鼠成體心肌細胞的分離和培養(yǎng)［J］. 第四軍醫(yī)大學學報，2005，26(17)：1154-1156.

［2］ 廖華，糜濤，涂志業(yè)，等.成年大鼠心肌細胞分離方法的改良［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(33)：6536-6539.

［3］ Loughrey CM，Seidler T，Miller SL，et al.Over-expression of FK506-binding protein FKBP12.6 alters excitation-contraction coupling in adult rabbit cardiomyocytes［J］.Physiol，2004，556(3)：919-934.

［4］ 宋智鋼，劉維永.成熟心肌細胞培養(yǎng)技術及其應用進展［J］.臨床心血管病雜志，2001，17(8)：383-384.

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［6］ 李洪，肖穎彬.成年大鼠心室肌細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定［J］. 第三軍醫(yī)大學學報，2004，26(7)：644-646.

［7］ 王麗娟，賈大林，齊國先.成年小鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)及鑒定［J］.中國實驗動物學報，2007，15(3)：175-178.

Pressure perfusion with collagenase typeⅡimproves the efficacy of isolation of adult rat cardiomyocytes

LI De，TANG Bing，YANG Da-chun，MA Shuang-tao，YANG Yong-jian
(Department of Cardiology，Chengdu Military Area Command General Hospital，Chengdu 610083，China)

Objective To explore a more effective method of isolation of adult rat cardiomyocytes.Methods Cardiomyocytes from SD rats were isolated by collagenase type II perfusion in the control group，and by pressure perfusion with collagenase type II in the experimental group.The morphology of cardiomyocytes was observed by optical microscopy and the cardiomyocyte viability was evaluated by trypan blue exclusion test and local field stimulation.Results The ratio of rod-shaped cells and yield of viable cells per rat were significantly higher in the experimental group than that in the control group［(90.3±4.4)% νs.(53.4±5.2)%，P ＜0.01;(3.6±0.7) × 107νs.(1.9±0.6) × 107，P ＜0.01］.During recalcification，the incidence of spontaneous contraction and deformation was significantly lower in the experimental group than that in the control group(10.4±2.1% νs.(18.9±4.5)%，P＜0.01;(5.3±1.3)% νs.(8.6±1.7)%，P＜0.05).The ratio of trypan blue test-negative cells and cells with contractile under local field stimulation were also significantly higher in the experimental group than that in the control group((95.3±8.2)% νs.(90.6±9.8)%，P＜0.05;(92.2±7.6)% νs.(85±6.4)%，P＜0.01).Conclusion Adult rat cardiomyocytes can be isolated more efficiently by collagenase typeⅡpressure perfusion.

Rat;Cardiomyocytes;cell separation

Q95-33，R542.2

A

1005-4847(2011)02-0150-03

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.014

心肌細胞已成為研究心肌結構、代謝、功能、病理生理、發(fā)病其機制及心肌疾病治療的重要工具。分離和培養(yǎng)胚胎期或新生期動物心肌細胞(未成熟心肌細胞)的實驗方法較為成熟，而成年動物心肌細胞(成熟心肌細胞)的分離和培養(yǎng)較為困難。未成熟心肌細胞無論在功能還是在結構等方面與成熟的心肌細胞相比均存在差異，因此，來自于未成熟心肌細胞實驗的結論難于推論于成熟心肌細胞，應用成熟心肌細胞進行心臟疾病發(fā)病機制和治療研究成為心血管病領域的重要課題［1］。但由于成熟心肌細胞分離和培養(yǎng)較困難，技術條件要求較高，限制了成熟心肌細胞在心臟疾病研究方面的應用。目前，大多數(shù)研究均采用 Langendorff裝置生物酶灌流消化法分離成熟心肌細胞［2，3］。在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)Langendorff裝置不易消毒滅菌，分離效果不穩(wěn)定，活細胞產(chǎn)量不高。我們對Langendorff裝置進行了改良，并通過加壓灌流控制流量，經(jīng)長期摸索，建立了較為穩(wěn)定的成年大鼠心肌細胞分離方法。

李德(1966-)，男，副主任醫(yī)師，博士，研究方向：心力衰竭與心律失常。

2010-09-27