張 建 雙, 于 爽, 郭 曉 兵, 郭 繼 強(qiáng)

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

海藻糖[1]由兩分子的吡喃葡萄糖單體以α-1,1糖苷鍵連接而成,許多報(bào)道[2]表明當(dāng)酵母細(xì)胞處于長(zhǎng)時(shí)間的饑餓、高滲、熱激以及孢子萌發(fā)等時(shí),細(xì)胞內(nèi)海藻糖的含量會(huì)發(fā)生顯著變化。因此海藻糖不僅可以作為碳源和能源,還具有保護(hù)生物細(xì)胞和生物活性物質(zhì)在脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒試劑等不良環(huán)境條件下活性免遭破壞的功能[3]。我國(guó)主要通過酵母法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[4]。酵母中的海藻糖合成酶[5]屬胞內(nèi)酶,通常需先將細(xì)胞破碎,經(jīng)分離純化[6]后才可使用,酶活損失較大,制約了酶法生產(chǎn)的工業(yè)化應(yīng)用。采用滲透處理細(xì)胞技術(shù)可省去海藻糖合成酶的分離及純化,整個(gè)透性化細(xì)胞可視為一個(gè)固定化酶。

透性化處理可使細(xì)胞內(nèi)合成的目標(biāo)產(chǎn)物釋放到細(xì)胞外,從而減少產(chǎn)物積累造成的產(chǎn)物反饋抑制現(xiàn)象[7]。作者以透性化酒精酵母細(xì)胞為研究對(duì)象,采用響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,從而使海藻糖最大限度的積累。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 菌 種

酒精酵母,大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20,硫酸鎂 0.5,磷酸氫二鉀10,氯化鈉20,酵母膏10。

1.2.2 試 劑

葡萄糖、酵母膏、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、蔗糖、吐溫-60、無水乙醇、蒽酮、濃硫酸等。

1.3 方 法

1.3.1 培養(yǎng)條件

發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL的三角瓶裝液80 mL,透性化細(xì)胞1 g,30 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。

1.3.2 酵母細(xì)胞滲透處理

取1 g濕酵母細(xì)胞懸浮于15 mL體積分?jǐn)?shù)為0.5% 的吐溫60溶液中,于30 ℃下振蕩反應(yīng)45 min,離心,收集菌體。菌體再用50 mmol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液重復(fù)洗滌2次,離心,最終收集的菌體即為透性化酵母細(xì)胞。

1.3.3 生物合成海藻糖

將透性化細(xì)胞加入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3.4 海藻糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

用0.5 mol/L的三氯乙酸冰浴提取胞內(nèi)海藻糖1 h[8],提取2次,提取液用蒽酮比色法測(cè)定海藻糖質(zhì)量濃度,并測(cè)出對(duì)應(yīng)的菌體生物量。每組實(shí)驗(yàn)平行3次,結(jié)果取平均值。

1.3.5 菌體生物量的測(cè)定

取發(fā)酵液10 mL于4 000 r/min離心15 min,沉淀,用去離子水洗滌2次,在干燥箱中80 ℃下烘干至恒重,稱量菌體干重。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.4.1 透性化酒精酵母培養(yǎng)基最適碳源的確定

改變“1.2.1”中發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的種類,分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖作為碳源,添加量為20 g/L,其他成分不變。30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h,離心收集菌體,測(cè)定海藻糖質(zhì)量濃度及菌體干重。

1.4.2 透性化酒精酵母培養(yǎng)基最適氮源的確定

以30 g/L的蔗糖為碳源,選用有機(jī)氮源(牛肉膏、酵母膏、蛋白胨)、無機(jī)氮源(硫酸銨、尿素)單一或復(fù)合物作為氮源,添加量為10 g/L,其他成分不變,30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h,離心收集菌體,測(cè)定海藻糖質(zhì)量濃度及菌體干重。

1.4.3 透性化酒精酵母培養(yǎng)基最適鹽濃度的確定

以30 g/L蔗糖為碳源,15 g/L酵母膏為碳源,分別添加10、20、30、40、50 g/L的氯化鈉和氯化鉀[9],其他成分不變,30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h,離心收集菌體,測(cè)定海藻糖質(zhì)量濃度及菌體干重。

1.4.4 響應(yīng)面法對(duì)海藻糖產(chǎn)生培養(yǎng)基的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步確定單因素的最佳添加量。以蔗糖、酵母膏、氯化鈉為自變量,以海藻糖質(zhì)量濃度為考察指標(biāo),運(yùn)用Minitab15數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,對(duì)培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳碳源及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

由圖1可以看出,不同碳源對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)及海藻糖的積累影響較大。當(dāng)以蔗糖為碳源時(shí),海藻糖質(zhì)量濃度和菌體干重均較高,且分別達(dá)到0.739和5.73 g/L。

圖1 不同碳源對(duì)海藻糖產(chǎn)量的影響

進(jìn)一步考察最適的蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見圖2。由圖2可知,蔗糖的濃度對(duì)海藻糖的積累具有較為顯著的影響,當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)海藻糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值0.831 g/L,菌體干重為6.73 g/L。濃度繼續(xù)增加,海藻糖質(zhì)量濃度開始降低,故蔗糖的量取30 g/L。

圖2 蔗糖對(duì)海藻糖產(chǎn)量的影響

2.2 最佳氮源及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

由圖3可知,培養(yǎng)基中的不同碳源對(duì)酵母細(xì)胞海藻糖的積累及菌體的生長(zhǎng)情況影響較大。總體看來,有機(jī)氮源的效果較好,其中酵母膏為氮源時(shí)效果最好,此時(shí)海藻糖質(zhì)量濃度為0.833 g/L,菌體干重為6.56 g/L。

進(jìn)一步考察最適酵母膏用量,結(jié)果見圖4。由圖4可知,不同濃度的酵母膏對(duì)海藻糖產(chǎn)量的影響較大。酵母膏濃度過低,菌體生長(zhǎng)較差,產(chǎn)海藻糖能力低；當(dāng)酵母膏添加量大于15 g/L時(shí),菌體干重及海藻糖量增加不明顯。因此選擇15 g/L的酵母膏為最適添加量,海藻糖質(zhì)量濃度為0.864 g/L,菌體干重為6.49 g/L。

1,牛肉膏10 g/L; 2,酵母膏10 g/L; 3,蛋白胨10 g/L; 4,牛肉膏5 g/L+硫酸銨5 g/L; 5,酵母膏5 g/L+硫酸銨5 g/L; 6,硫酸銨10 g/L; 7,尿素10 g/L

圖4 酵母膏對(duì)海藻糖產(chǎn)量的影響

2.3 最佳鹽及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

由圖5、6可知,適當(dāng)濃度的氯化鈉和氯化鉀均有利于海藻糖的積累,但兩者比較之后,可以看出添加氯化鈉得到的海藻糖質(zhì)量濃度及菌體干重均較大,因此選擇添加30 g/L的氯化鈉,此時(shí)海藻糖質(zhì)量濃度為0.910 g/L,菌體干重為6.44 g/L。

圖5 氯化鈉對(duì)海藻糖產(chǎn)量的影響

圖6 氯化鉀對(duì)海藻糖產(chǎn)量的影響

2.4 響應(yīng)面法對(duì)海藻糖產(chǎn)生培養(yǎng)基的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì),以海藻糖質(zhì)量濃度為考察指標(biāo),因素水平編碼見表1。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸,以海藻糖質(zhì)量濃度(Y)為因變量,以酵母膏(X1)、蔗糖(X2)、氯化鈉(X3)質(zhì)量濃度為自變量建立回歸方程：

Y=0.915 67-0.020 13X1-0.073 66X2-

0.006 5X1X3-0.002 075X2X3

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平

從表2可知,海藻糖質(zhì)量濃度與實(shí)驗(yàn)3個(gè)因素的回歸方程的F值為463.59,方程顯著?；貧w方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的均方差和系數(shù)比較大,且P<0.01,說明顯著；而交互項(xiàng)比較小,所以,響應(yīng)面分析所選的3個(gè)因素(酵母膏、蔗糖和氯化鈉質(zhì)量濃度)之間的交互效應(yīng)比較小,且P>0.05。因此各項(xiàng)因素與海藻糖質(zhì)量濃度之間是相對(duì)較為簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,失擬項(xiàng)P>0.05表明該方程可以接受,可以用此模型對(duì)發(fā)酵液的海藻糖質(zhì)量濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)。

利用Minitab15數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到響應(yīng)面以及對(duì)應(yīng)等高線圖,見圖7。由圖7可以直觀地看出各個(gè)自變量對(duì)響應(yīng)值的變化趨勢(shì),而且回歸模型存在最大值,同時(shí)可以看出3個(gè)因素對(duì)海藻糖積累的影響顯著性為：酵母膏>蔗糖>氯化鈉。

根據(jù)擬合方程對(duì)方程求導(dǎo),得到最佳因素編碼：X1=-0.062 3,X2=-0.245 4,X3=-0.256 6,即最適培養(yǎng)基組成為：酵母膏14.7 g/L,蔗糖32.5 g/L,氯化鈉27.4 g/L。由回歸方程可以確定海藻糖最大質(zhì)量濃度為 0.931 9 g/L。

圖7 響應(yīng)面三維圖和對(duì)應(yīng)的等高線圖

2.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性,根據(jù)以上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得的各因素優(yōu)化值,進(jìn)行透性化酒精酵母培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),經(jīng)優(yōu)化后其海藻糖的產(chǎn)量可以達(dá)到0.921 0 g/L,與預(yù)測(cè)值0.931 9 g/L接近,可見該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面法對(duì)透性化酒精酵母細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基組成的研究,得出最佳培養(yǎng)基組成為:酵母膏14.7 g/L,蔗糖32.5 g/L,氯化鈉27.4 g/L,此時(shí)海藻糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.931 9 g/L。

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