聶 妤, 董 亮, 侯 德 文, 李 明 達(dá), 王 曉 丹, 趙 長(zhǎng) 新

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.華潤(rùn)雪花啤酒(盤(pán)錦)有限公司, 遼寧 盤(pán)錦 124010 )

0 引 言

酵母菌株對(duì)濃度較大的乙醇的耐受性存在明顯的差異[1],而其耐酒精的生化機(jī)理對(duì)于提高工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酒精和研究酵母抵抗不良環(huán)境生命機(jī)制有著重要的理論和實(shí)際意義,近幾年來(lái)科研工作者從自然界中分離得到或通過(guò)遺傳工程手段構(gòu)建了一些能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生高濃度酒精(發(fā)酵液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到17.5%以上,而普通酵母菌只能產(chǎn)生9%～11%乙醇)的酵母菌,同時(shí)開(kāi)展了大量的酵母菌耐酒精的生化機(jī)制的研究工作,發(fā)現(xiàn)酵母菌耐酒精的生理機(jī)理是十分復(fù)雜的[2-4]。細(xì)胞中的許多組分與酵母菌耐酒精能力有密切的關(guān)系,并且細(xì)胞的許多基因控制著酵母菌耐酒精的特性,而且這些具體生化機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究[5-6]。

本文以酶學(xué)研究為切入點(diǎn),通過(guò)對(duì)不同酒精體積分?jǐn)?shù)下的酵母細(xì)胞糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)處的關(guān)鍵酶進(jìn)行分析,關(guān)鍵酶活力的變化一定程度上反映了其對(duì)酒精的耐受能力,為酵母對(duì)酒精耐受的生化機(jī)理研究提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeFCC 2146,由大連工業(yè)大學(xué)生物與食品學(xué)院保藏所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(100 mL):蛋白胨2 g,葡萄糖2 g,酵母提取粉1 g,pH 6.0,0.1 MPa,115 ℃,滅菌20 min。

供試培養(yǎng)基是在此培養(yǎng)基中添加一定量的乙醇。

①YPD對(duì)照；②YPD+2 mL乙醇；③YPD+4 mL乙醇；④YPD+6 mL乙醇；⑤YPD+8 mL乙醇。

1.1.3 儀 器

TGL-16G臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；B-22M超高速冷凍離心機(jī),Thermo IEC公司；全溫落地式搖床,上海精宏儀器設(shè)備有限公司；JY99-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝科器研究所。

1.2 方 法

1.2.1 酵母培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng):按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于上述①、②、③號(hào)培養(yǎng)基中,在500 mL錐形瓶裝液150 mL,30 ℃、230 r/min下在往復(fù)式振蕩搖床培養(yǎng)24 h。定時(shí)無(wú)菌操作取10 mL發(fā)酵液維素酯濾膜進(jìn)行真空超濾用于分析。

種子培養(yǎng):菌種復(fù)壯后,挑取1菌環(huán)酵母置于含有50 mL無(wú)菌YNB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在30 ℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)24 h,制備正處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸濁液。

1.2.2 酶活力檢測(cè)

在YPD培養(yǎng)基中添加乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%。接入S.cerevisiae連續(xù)培養(yǎng),在它們各自的對(duì)數(shù)期取樣,測(cè)定中間代謝途徑中的一些關(guān)鍵酶活性隨乙醇的變化,并繪制變化曲線。包括磷酸戊糖途徑(6-磷酸葡萄糖脫氫酶,G6PDH),糖酵解途徑(丙酮酸激酶,PYK),檸檬酸循環(huán)(蘋(píng)果酸脫氫酶,MDH；異檸檬酸脫氫酶,ICDH；異檸檬酸裂解酶,ICL)以及乙醇脫氫酶YADH活性。丙酮酸激酶按參考文獻(xiàn)[7]的方法測(cè)定,異檸檬酸脫氫酶按參考文獻(xiàn)[8]的方法測(cè)定,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶按參考文獻(xiàn)[9]的方法測(cè)定,蘋(píng)果酸脫氫酶按參考文獻(xiàn)[10]的方法測(cè)定,乙醇脫氫按酶參考文獻(xiàn)[11]的方法測(cè)定。酶活力單位的定義為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需要的酶量為1個(gè)活力單位(U)。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙酮酸激酶對(duì)乙醇的耐受性分析

由圖1可以看出,丙酮酸激酶活力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而減小。在不添加乙醇條件下,酵母細(xì)胞內(nèi)丙酮酸激酶活力最高為0.682 U；在乙醇體積分?jǐn)?shù)8%時(shí),酵母細(xì)胞內(nèi)丙酮酸激酶活力最低為0.022 U。而在乙醇體積分?jǐn)?shù)2%時(shí),酵母細(xì)胞內(nèi)丙酮酸激酶活力為0.152 U,較無(wú)乙醇的酶活力降低了77.7%。說(shuō)明丙酮酸激酶活力對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)變化較為敏感,耐受性比較差。PYK活性提高有利于糖酵解途徑進(jìn)行的順利,反之該酶活性降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量的供應(yīng)受到影響。它在細(xì)胞內(nèi)含量的多少反映了細(xì)胞內(nèi)流經(jīng)糖酵解途徑的通量大小。

圖1 丙酮酸激酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化曲線

2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶對(duì)乙醇的耐受性分析

由圖2可見(jiàn),葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而略有增加。在無(wú)乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細(xì)胞內(nèi)丙酮酸激酶活力最低為0.148 U；在乙醇體積分?jǐn)?shù)8%時(shí),酵母細(xì)胞內(nèi)丙酮酸激酶活力最高,為0.183 U,較無(wú)乙醇條件下酶活力提高了23.65%,由此可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力的影響較小,耐受性較強(qiáng)。綜上說(shuō)明,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,酵母細(xì)胞內(nèi)的PP途徑也相應(yīng)地增大,以提供大量的NADPH還原力以減輕乙醇對(duì)細(xì)胞的毒害作用。

圖2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化曲線

2.3 蘋(píng)果酸脫氫酶對(duì)乙醇的耐受性分析

由圖3可見(jiàn),蘋(píng)果酸脫氫酶活力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。在無(wú)乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細(xì)胞內(nèi)蘋(píng)果酸脫氫酶活力最低為0.032 U；在乙醇體積分?jǐn)?shù)8%時(shí),酵母細(xì)胞內(nèi)蘋(píng)果酸脫氫酶活力最高為0.114 U,較無(wú)乙醇條件下酶活力提高了256.25%。從圖3中可以看出,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于4%時(shí),蘋(píng)果酸脫氫酶活力升高較為顯著,由0.045 U升高至0.106 U。由此可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加能夠增加蘋(píng)果酸脫氫酶的活力,蘋(píng)果酸脫氫酶對(duì)乙醇的耐受性較強(qiáng),當(dāng)胞外乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)4%時(shí),蘋(píng)果酸脫氫酶活力較高,TCA循環(huán)中該酶所催化的代謝反應(yīng)較為活躍。

圖3 蘋(píng)果酸脫氫酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化曲線

2.4 異檸檬酸脫氫酶對(duì)乙醇的耐受性分析

由圖4可見(jiàn),異檸檬酸脫氫酶活力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而減小。在無(wú)乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細(xì)胞內(nèi)異檸檬酸脫氫酶活力最高,為0.201 U；在乙醇體積分?jǐn)?shù)8%時(shí),酵母細(xì)胞內(nèi)異檸檬酸脫氫酶活力最低,為0.003 U。說(shuō)明異檸檬酸脫氫酶活力對(duì)于乙醇體積分?jǐn)?shù)較為敏感,耐受性比較差。由此可知,在外源乙醇體積分?jǐn)?shù)較高的情況下,異檸檬酸脫氫酶活力很低,說(shuō)明異檸檬酸并不是由異檸檬酸脫氫酶催化生成α-酮戊二酸,而很可能是由異檸檬酸裂解酶將其催化生成琥珀酸和乙醛酸。

圖4 異檸檬酸脫氫酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化曲線

2.5 異檸檬酸裂解酶對(duì)乙醇的耐受性分析

由圖5可見(jiàn),異檸檬酸裂解酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大。在無(wú)乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細(xì)胞內(nèi)的異檸檬酸裂解酶活力最低,為0.302 U；在乙醇體積分?jǐn)?shù)8%時(shí),酵母細(xì)胞內(nèi)異檸檬酸裂解酶活力最高,為1.136 U,較無(wú)乙醇條件下酶活力提高了276.16%。由圖5可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大能夠使異檸檬酸裂解酶活力增大,外源乙醇的添加對(duì)異檸檬酸裂解酶活力有一定的促進(jìn)作用。這與“2.4”所做出的推斷相符。

圖5 異檸檬酸裂解酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化曲線

說(shuō)明異檸檬酸在TCA循環(huán)中的去路主要是通過(guò)異檸檬酸裂解酶轉(zhuǎn)化而成乙醛酸和琥珀酸,這種轉(zhuǎn)變是由外源乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大所引起的。

2.6 乙醇脫氫酶對(duì)乙醇的耐受性分析

由圖6可見(jiàn),乙醇脫氫酶活力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而減小。在無(wú)乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細(xì)胞內(nèi)乙醇脫氫酶活力最高,為3.779 U；在乙醇體積分?jǐn)?shù)8%時(shí),酵母細(xì)胞內(nèi)乙醇脫氫酶活力最低為0.467 U。而在乙醇體積分?jǐn)?shù)2%時(shí),酵母細(xì)胞內(nèi)乙醇脫氫酶活力為1.409 U,較無(wú)乙醇添加條件下的酶活力降低了62.72%。說(shuō)明乙醇脫氫酶活力對(duì)于乙醇較為敏感,耐受性比較差,較低體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)其活性產(chǎn)生較大的抑制作用。乙醇脫氫酶的酶活高,可以快速地將碳源轉(zhuǎn)化為乙醇,減少代謝中間產(chǎn)物丙酮酸在其他代謝途徑上的代謝通量。而過(guò)量乙醇的反饋抑制使乙醇脫氫酶的酶活降低,不能及時(shí)地將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇,導(dǎo)致代謝中間產(chǎn)物丙酮酸積累,使丙酮酸流向乙醛途徑和乳酸途徑等。

圖6 乙醇脫氫酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化曲線

3 結(jié) 論

分別考查了乙醇體積分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%時(shí)的酵母細(xì)胞糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、異檸檬酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、異檸檬酸裂解酶活力等關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)處的酶活力,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酒精的耐受能力較強(qiáng),酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高變化不大；丙酮酸激酶、異檸檬酸脫氫酶和乙醇脫氫酶表現(xiàn)出對(duì)酒精的耐受力較差,其酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而降低；蘋(píng)果酸脫氫酶和異檸檬酸裂解酶表現(xiàn)出對(duì)酒精良好的耐受性,其酶活力變化隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增大。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),由于在乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí),異檸檬酸脫氫酶活力的降低及異檸檬酸裂解酶活力的大幅度提高,導(dǎo)致酵母細(xì)胞的能量代謝途徑發(fā)生變化,TCA循環(huán)被抑制,異檸檬酸在TCA循環(huán)中主要是通過(guò)異檸檬酸裂解酶轉(zhuǎn)化而成乙醛酸和琥珀酸,后通過(guò)乙醛酸循環(huán)的回補(bǔ)途徑。

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