田丹丹，宋修鵬，蔣承健，古恒森，李俊芳，武波

( 1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005 ; 2.微生物及植物遺傳工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530005 ; 3.廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530005 ; 4.廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院，廣西南寧530007 )

1株甲基桿菌Methylobacterium sp.WGM16的鑒定及降解甲醇的最佳培養(yǎng)條件

田丹丹1，2，3，宋修鵬1，2，3，蔣承健1，2，3，古恒森1，2，3，李俊芳1，2，3，武波2，3，4*

( 1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005 ; 2.微生物及植物遺傳工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530005 ; 3.廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530005 ; 4.廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院，廣西南寧530007 )

從水稻根部土壤中篩選到1株粉紅色、需氧的兼性甲基營(yíng)養(yǎng)型菌株WGM16，該菌為革蘭陰性桿菌。根據(jù)菌株16S rRNA基因序列比對(duì)分析及結(jié)合菌株常規(guī)形態(tài)特征、生理生化性狀的鑒定，將該菌初步鑒定為Methylobacterium sp.PCR擴(kuò)增到菌株WGM16編碼甲醇脫氫酶α-亞基的mxaF基因，表明菌株WGM16中存在甲基營(yíng)養(yǎng)代謝途徑。在培養(yǎng)溫度為32℃、以1%的甲醇作為碳源、pH值為8.0的培養(yǎng)條件下，其甲醇降解率可達(dá)75%。

甲基桿菌;WGM16;鑒定;甲醇降解率

甲基營(yíng)養(yǎng)菌是一類能夠利用包含一個(gè)碳原子，或包含多個(gè)碳原子但碳原子之間卻沒有碳碳鍵的化合物作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的微生物［1］。它們能夠利用大多數(shù)生物不能夠利用的一類物質(zhì)，如甲醇、甲醛、甲胺、甲酸。甲基桿菌屬是粉紅色的、需氧的、革蘭陰性桿狀的兼性甲基營(yíng)養(yǎng)菌［2］。甲基桿菌屬除了能利用上述單碳化合物作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)外，也能夠利用一系列廣泛的多碳化合物作為底物生長(zhǎng)。甲基桿菌在自然界中普遍存在，在各種環(huán)境中(如土壤、灰塵、淡水、湖泥、葉表、根瘤、稻谷、醫(yī)院環(huán)境)都有存在［3］。它們能夠代謝存在于植物碎屑中的微細(xì)產(chǎn)物。因此，甲基桿菌在自然界碳循環(huán)中起到重要的作用。甲醇、甲醛對(duì)人體和各種微生物都有毒性。甲基桿菌可通過(guò)其一碳代謝途徑將甲醇、甲醛等進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，因此可以利用其進(jìn)行甲醇廢水的處理。在利用單碳化合物作為碳源和能源生長(zhǎng)的同時(shí)，其會(huì)代謝產(chǎn)生多種有益的副產(chǎn)物，如甲醇蛋白、多種輔酶、維生素B12、聚β羥基丁酸鹽、各種氨基酸(L-絲氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸)等［4］。本研究從水稻根部通過(guò)富集培養(yǎng)分離到了1株甲基桿菌WGM16，豐富了甲基營(yíng)養(yǎng)菌的物種資源，可為研究甲基桿菌的一碳代謝途徑提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基①完全培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，葡萄糖4 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0;②基本培養(yǎng)基:(NH4)2HPO43 g/L，K2HPO42 g/L，NaCl 1 g/L，煙酸20 μg/L，VB110 μg/L，VB220 μg/L，泛酸鈣20 μg/L，吡哆醇20 μg/L，生物素10 μg/L，對(duì)氨基苯甲酸10 μg/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·4～6H2O 5 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離及純化取水稻根部附近1 g土樣，用100 mL無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，取1 mL稀釋液加入到100 mL含1%無(wú)水甲醇的完全培養(yǎng)基中30℃富集3～4 d，然后涂布到以1%的無(wú)水甲醇為唯一碳源和能源的基本培養(yǎng)基的平板上，放入30℃恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d，挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株反復(fù)劃線純化。

1.2.2 菌株的鑒定①菌株形態(tài)特征及生理生化特征測(cè)定:見參考文獻(xiàn)［5］;②16S rRNA基因序列、mxaF基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析:用購(gòu)自BioFlux的基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株的基因組DNA作為模板，用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')擴(kuò)增該菌株的16S rRNA。用mxaF-f(5'-GCGGCACCAACTGGGGCTGGT-3')和mxaF-r(5'-GGGCAGCATGAAGGGCTCCC-3')擴(kuò)增該菌株的mxaF基因。PCR產(chǎn)物電泳后用BioFlux公司的凝膠回收試劑盒純化后送上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA 4.0版本進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)條件的優(yōu)化以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌液(OD600=0.8)按1%的接種量接入到100 mL的三角瓶中，檢測(cè)菌株在不同甲醇濃度、溫度、pH下OD600的吸收值。

1.2.4 甲醇?xì)堄嗔繖z測(cè)用氣相色譜法檢測(cè)菌株對(duì)甲醇的利用情況。島津GC-14C型氣相色譜，F(xiàn)ID檢測(cè)器，高純氮?dú)鉃檩d氣，固定液:OV-1701，擔(dān)體:Chromosorb WAW DMCS。柱溫:60℃，進(jìn)樣器:180℃，檢測(cè)器:210℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 WGM16的形態(tài)及生理特征鑒定

WGM16在固體基本培養(yǎng)基中，菌落圓形，不透明，粉紅色，表面光滑，邊緣整齊。光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞桿狀。革蘭陰性，有類脂粒(聚-β-羥基丁酸鹽顆粒)。電鏡下觀察WGM16具有鞭毛(見圖1)。WGM16具有Nm、Amp、Cb抗性。

圖1 菌株WGM16在透射電鏡下的照片F(xiàn)ig.1Transmission electron microscopy micrograph of strain WGM16

2.2 WGM16的分子生物學(xué)分析鑒定

2.2.1 16S rRNAPCR擴(kuò)增WGM16的16S rRNA，連載體后送生工測(cè)序，得到1446 bp的片段。在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)與M.lusitanum MP2的16S rRNA有99%的序列相似性。

2.2.2 mxaF基因PCR擴(kuò)增WGM16的mxaF基因連載體后測(cè)序得到530 bp的片段。在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)與Methylobacterium lusitanum strain MP2 methanol dehydrogenase有98%的序列相似性。

圖2 根據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建的WGM16和甲基桿菌屬其他相關(guān)菌株的進(jìn)化樹Fig.2Phylogenetic dendrogram obtained by 16S rRNA gene sequences，showing the position of strain WGM16 among its phylogenetic neighbours

圖3 根據(jù)mxaF基因序列構(gòu)建的WGM16和其他相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3Phylogenetic dendrogram obtained by distance-matrix analysis of mxaF gene sequences，showing the position of strain WGM16 among its phylogenetic neighbours

2.3 生理生化鑒定

根據(jù)細(xì)菌鑒定手冊(cè)中鑒定甲基桿菌屬的主要生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，如表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株WGM16與甲基桿菌屬主要指標(biāo)都相符。表明WGM16為甲基桿菌屬。

2.4 WGM16對(duì)碳源的利用情況

用Biolog公司的細(xì)菌鑒定儀對(duì)菌株WGM16做碳源情況分析，發(fā)現(xiàn)WGM16能利用D-麥芽糖、D-海藻糖、蔗糖、D-松二糖、棉子糖、N-乙酰-D-葡糖胺、α-D-葡萄糖、D-果糖、1%乳酸鈉、D-絲氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、鹽酸胍、L-乳酸、檸檬酸、D-蘋果酸、溴-丁二酸、氯化鋰、萘啶酮酸、亞碲酸鉀、β-羥基-L-丁酸、丙酸、乙酸、氨曲南、丁酸鈉。根據(jù)WGM16在進(jìn)化樹分支中的位置，比較WGM16與Methylobacterium lusitanum［6］、Methylobacterium thiocyanatum［7］、Methylobacterium rhodesianum［8］、Methylobacterium populi［9］對(duì)不同碳源的利用情況，如表2所示。

表1 WGM16和甲基桿菌屬生理生化性質(zhì)的比較Table 1Comparation of the physiological and biochemical of WGM16 with related Methylobacterium sp.members

表2 甲基桿菌屬對(duì)不同碳源底物的利用情況Table 2Differential carbon-substrate utilization among Methylobacterium species

2.5 甲醇降解的最佳培養(yǎng)條件

2.5.1 不同甲醇濃度對(duì)WGM16生長(zhǎng)的影響

將WGM16接種于甲醇含量為1%、2%、3%為唯一碳源和能源的基本培養(yǎng)基上，pH 7.0，32℃搖床培養(yǎng)，每隔6 h測(cè)定菌株OD600。由圖4可知，菌株WGM16在甲醇濃度為1%時(shí)長(zhǎng)勢(shì)較好。

圖4 WGM16在不同甲醇濃度下的生長(zhǎng)曲線Fig.4The growth curve of WGM16 on different content of methanol

2.5.2 不同pH對(duì)WGM16生長(zhǎng)的影響將WGM16接種于1%的甲醇為唯一碳源和能源、pH分別為5、6、7、8、9的基本培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)，每隔6 h測(cè)定菌株OD600。菌株WGM16在pH 8.0時(shí)明顯比其他pH時(shí)長(zhǎng)勢(shì)好，在pH 5.0及pH 6.0時(shí)基本不長(zhǎng)，見圖5。

圖5 WGM16在不同pH下的生長(zhǎng)曲線Fig.5The growth curve of WGM16 on different pH

2.5.3 不同溫度對(duì)WGM16生長(zhǎng)的影響將WGM16接種于1%的甲醇為唯一碳源和能源，pH 8.0的基本培養(yǎng)基上，分別放入28、30、32、37℃搖床中，每隔6 h測(cè)定菌株OD600。由圖6可知，菌株WGM16在溫度為32℃時(shí)長(zhǎng)勢(shì)明顯比其他溫度要好。

圖6 WGM16在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線Fig.6The growth curve of WGM16 on different temperature

2.6 WGM16的耐鹽性分析

將WGM16接種于1%的甲醇為唯一碳源和能源，pH 8.0，NaCl濃度分別為1%、2%、5%、7%、10%的基本培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)，每隔6 h測(cè)定菌株OD600。由圖7可知，菌株WGM16具有較高的耐鹽性。

圖7 WGM16在不同NaCl濃度的生長(zhǎng)曲線Fig.7The growth curve of WGM16 on different content of NaCl

2.7 WGM16在不同時(shí)間對(duì)甲醇的降解情況

將WGM16按1%的接種量接種到1%的甲醇為唯一碳源和能源，pH 8.0的基本培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，檢測(cè)菌株WGM16在生長(zhǎng)過(guò)程中甲醇的降解情況，發(fā)現(xiàn)最終可降解75%的甲醇，見圖8。

圖8 WGM16在不同時(shí)間內(nèi)的甲醇降解率Fig.8The degradation curve of methanol during the growth of WGM16

3 討論

本研究從水稻根部土壤中篩選到1株產(chǎn)粉紅色色素的兼性甲基營(yíng)養(yǎng)菌。分析菌株16S rRNA序列和其在進(jìn)化樹中的位置以及與甲基桿菌屬各項(xiàng)生理生化特征的比較，表明菌株WGM16屬于甲基桿菌屬。菌株WGM16在進(jìn)化樹中的位置與M.lusitanum最近，但是與M.lusitanum不同的是WGM16能夠利用葡萄糖和二甲胺，而M.lusitanum卻不能利用，WGM6不能夠利用甲酸，M.lusitanum卻能夠利用。表明菌株WGM16可能是甲基桿菌屬中的一個(gè)新種。PCR擴(kuò)增到菌株WGM16編碼甲醇脫氫酶α-亞基的mxaF基因，表明菌株WGM16中存在甲基營(yíng)養(yǎng)代謝途徑。菌株WGM16為微嗜堿性菌株，在pH為5.0和6.0時(shí)基本不長(zhǎng)。在4℃和37℃時(shí)都不能生長(zhǎng)。菌株WGM16有很高的耐鹽性，1%≤NaCl濃度≤10%時(shí)都能生長(zhǎng)。在1%的甲醇為碳源、pH 8.0、32℃時(shí)菌株WGM16長(zhǎng)勢(shì)最好。在此條件下對(duì)甲醇的降解率可達(dá)到75%。菌株WGM16能產(chǎn)生β-羥基丁酸鹽顆粒，可為研究一碳代謝途徑中PHB的循環(huán)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)該菌能夠生產(chǎn)L-絲氨酸，但也能夠利用L-絲氨酸作為氮源生長(zhǎng)，對(duì)研究微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸具有應(yīng)用價(jià)值。

［1］Anthony，C.The biochemistry of methylotrophs［M］.Academic Press，London，United Kingdom，1982，2.

［2］Green，p.N.The genus Methylobacterium［M］.In The Pro-karyotes(2ndedn).New York:Springer，1999:2342-2349.

［3］Corpe，W.A.＆Rheem，S.Ecology of the methylotrophic bacteria on living leaf surfaces［J］.FEMS Microbiol Ecol，1989，(62):243-250.

［4］Green，P.N.Methylobacterium［J］.Prokaryotes，2006，(5): 257-265.

［5］東秀珠，蔡妙英，等.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:353-398.

［6］Doronina，N V.Trotsenko，Y A.Tourova，T P，et al.Methylobacterium suomiense sp.nov.and Methylobacterium Lusitanum so.nov.，aerobic，pink-pigmented，facultativelymethylotrophic bacteria［J］.Int J Syst Evol Microbiol，2002，(52):773-776.

［7］Ann P W，Donovan P K，Ian P M，et al.A novel pink-pigmented facultative methylotroph，Methylobacterium thiocyanatum sp.nov.，capable of growth on thiocyanate or cyanate as sole nitrogen sources［J］.Arch Microbiol，1998，(169):148-158.

［8］Rock，J S.Goldberg，I.Ben-Bassat，A.et al.Isolation and characterization of two methanol-utilizing bacteria［J］.Agric Biol Chem，1976，(40):2129-2135.

［9］Van Aken，B.Peres，C M.Lafferty Doty，S.et al.Methylobacterium populi sp.nov.a novel aerobic，pink-pigmented，facultatively methylotrophic，methane-utilizing bacterium isolated from poplar trees［J］.Int J Syst Evol Microbiol，2004，(54):1191-1196.

Identification of a Methylobacterium sp.Strain WGM16 and Its Optimal Culture Conditions to Degrade Methanol

TIAN Dan-dan1，2，3，SONG Xiu-peng1，2，3，JIANG Cheng-jian1，2，3，GU Heng-sen1，2，3，LI Jun-fang1，2，3，WU Bo2，3，4
(1.Coll.of Life Sci.＆Technol.，Guangxi Uni.，Nanning 530005; 2.Key Lab.of Microbial＆Plant Gen.Engin.of Min.of Educ.，Nanning 530005; 3.Key Lab.of Subtrop.Bio-Res.Conserv.＆Util.of Guangxi，Nanning 530005; 4.Coll.of Chem.and Ecol.Engin.，Guangxi Uni.for Nationalities，Nanning 530007)

A pink，aerobic，and facultative methylotrophic bacterium strain WGM16，was isolated and screened from rice’s root soil.It was Gram-negative rod.Comparison analysis of 16S rRNA gene sequence and physiological and biochemical characteristics combined with routine morphological，physiological and biochemical characteristics identification，the strain WGM16 was identified as a member of the genus Methylobacterium sp.PCR amplification showed the gene coding for the α-sub-radical of methanol dehydrogenase(mxaF)present in the strain WGM16，indicating there existed a methylotrophic metabolism.Under the conditions of temperature at 32℃，with 1%of methanol as carbon source，pH 8.0，the methanol degradation rate was as high as 75%.

Methylobacterium;WGM16;identification;methanol degradation rate

S154.3

A

1005－7021(2011)01－0028－06

廣西青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(桂科青0832011);廣西大學(xué)科研基金(X081074)

田丹丹女，碩士研究生。研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。

*通訊作者。Tel:0771-3239283，E-mail:wubogxu@yahoo.com.cn

2010-11-22;

2010-01-14