丁彥庭,張成麗,周艷梅＊,竇俊超

(1.河南大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗教學(xué)中心,河南開封 475004; 2.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,河南開封 475004）

鹽酸強(qiáng)力霉素分子印跡聚合物的制備及分子識別性能

丁彥庭1,張成麗2,周艷梅2＊,竇俊超2

(1.河南大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗教學(xué)中心,河南開封 475004; 2.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,河南開封 475004）

以鹽酸強(qiáng)力霉素(DC)為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑、四氫呋喃(THF)為溶劑,采用本體聚合法制備了DC的分子印跡聚合物.在水溶液中,采用平衡結(jié)合方法和Scatchard模型評價了該聚合物的結(jié)合特性及識別機(jī)理,并考察了DC分子印跡聚合物的選擇性吸附能力.結(jié)果表明,在所研究的濃度范圍內(nèi),DC分子印跡聚合物中形成兩類不同的結(jié)合位點(diǎn);高親和力結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別為 Kd1=116.83μmol·L-1,Qmax1=68.98μmol·g-1;低親和力結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別為 Kd2=12.75μmol·L-1,Qmax2=15.13μmol·g-1.與此同時,DC分子印跡聚合物對DC呈現(xiàn)出高的選擇吸附特性.

鹽酸強(qiáng)力霉素;分子印跡聚合物;制備;分子識別;應(yīng)用

Abstract:Molecular imprinted polymers of doxycycline hydrochloride(DC)were synthesized viabulk polymerization route by using DC as the template molecule,methacrylic acid as the functional monomers,and ethylene dimethacrylate(EGDMA)as the crosslinker.Equilibrium binding experiments and Scatchard analysis were made to evaluate the binding characteristics and recognition mechanism of the DC molecular imprinted polymers in aqueous solution.Scatchard analysis showed that two classes of binding sites were produced in the polymer matrix within tested concentration range.The dissociation constant(Kd)and apparent maximum binding capacity(Qmax)for high affinity binding sites wereKd1=116.83μmol·L-1andQmax1=68.98μmol·g-1,and those for low affinity binding sites wereKd2=12.75μmol·L-1and Qmax2=15.13μmol·g-1.At the same time,the imprinted polymers possessed good selective adsorption capacity for DC.

Keywords:doxycycline hydrochloride;molecularly imprinted polymers;preparation;molecular recognition;application

分子印跡技術(shù)(MIT)是用于識別特定目標(biāo)分子的技術(shù),分子印跡聚合物(MIPs)[1-2]是首先由模板分子與可聚合的功能單體通過靜電作用、范德華力、疏水作用和氫鍵等非共價鍵或共價鍵作用形成主客體配合物,加入引發(fā)劑和交聯(lián)劑進(jìn)行聚合反應(yīng),制得高分子聚合物,然后利用化學(xué)或物理方法除去模板分子,得到能“記憶”模板分子構(gòu)型和功能基團(tuán)的剛性聚合物,從而對模板分子表現(xiàn)出特異的識別能力.MIPs不但具有選擇性高、穩(wěn)定性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),而且具有較強(qiáng)的分離和富集能力,已逐漸發(fā)展成為化學(xué)化工領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn),在催化、色譜分離[3]、過程監(jiān)測和分析[4-6]、生物傳感器[7]等領(lǐng)域均得到了快速發(fā)展.

鹽酸強(qiáng)力霉素(DC)屬于第二代四環(huán)素類抗生素,對溶血性鏈球菌、葡萄球菌等革蘭氏陽性菌,多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抑制作用,抗菌范圍較廣,被大量應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖,部分DC會殘留在生物體內(nèi),由此可能導(dǎo)致食品中DC藥物殘留超標(biāo),從而對消費(fèi)者造成危害.因此,建立快速、高選擇性富集DC的方法,以便于DC的過程監(jiān)測,對保障食品安全具有重要的科學(xué)意義.在過程監(jiān)測中往往需要首先富集樣品,而目前對于DC的富集還沒有高選擇性的方法.本文作者利用新型分子印跡技術(shù),以DC為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體,首次合成了DC分子印跡聚合物,研究了其對DC的動力學(xué)吸附性能.采用平衡結(jié)合方法和Scatchard模型評價了該聚合物的結(jié)合特性及識別機(jī)理,考察了其選擇性吸附能力.

1 實(shí)驗部分

1.1 試劑與儀器

鹽酸強(qiáng)力霉素(開封制藥廠);α-甲基丙烯酸(MAA,天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心,使用前減壓蒸餾除去阻聚劑);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA,ACROS試劑);偶氮二異丁腈 (AIBN,上海化學(xué)試劑公司,使用前重結(jié)晶);四氫呋喃(天津市大茂化學(xué)試劑廠).實(shí)驗中所用水均為二次水、所用試劑均為分析純.

LabTech-1000型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司);SKY-100C型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司);KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

1.2 分子印跡聚合物的制備

稱取適量DC溶于20.0 mL THF中,超聲5 min,待完全溶解后,加入適量的MAA,振蕩6 h使DC與MAA充分作用,加入適量交聯(lián)劑EGDMA和50 mg引發(fā)劑AIBN,于50 mL具塞比色管中,混合均勻,通氮?dú)饷撗?5 min后,密封,并將其放入60℃水浴中聚合反應(yīng)24 h,所得淺黃色棒狀聚合物經(jīng)粉碎后過200目篩,使用V(甲醇)∶V(乙酸)=9∶1混合溶液洗至紫外分光光度計檢測不出DC為止,最后用蒸餾水洗滌除去殘留的乙酸和甲醇.得到的聚合物在恒溫真空干燥箱中于60℃干燥24 h,即制得DC印跡聚合物(MIP).

非印跡聚合物 (NMIP)的制備,除不加DC外,其余步驟同MIP的制備.

1.3 MIP的靜態(tài)結(jié)合實(shí)驗

準(zhǔn)確稱取MIP或NMIP 40.0 mg放入10 mL試管中,加入5.0 mL已知濃度的DC水溶液,置于25℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中,于室溫下振蕩8 h,用0.22μm的濾膜過濾,濾液用紫外分光光度法測定DC的平衡濃度,根據(jù)吸附前后溶液中DC的濃度變化,計算聚合物的吸附量Q,平行測定三次取平均值.吸附DC后的MIP按照制備過程洗脫模板的方法洗去DC后,可以重復(fù)利用.

2 結(jié)果與討論

2.1 功能單體、交聯(lián)劑用量對聚合物吸附效果的影響

改變功能單體、交聯(lián)劑的用量,分別合成出不同比例下的MIP和NMIP,然后在相同條件下進(jìn)行靜態(tài)結(jié)合實(shí)驗,結(jié)果如表1所示,表中M1、M2、M3、M4為印跡聚合物,N1、N2、N3、N4為對應(yīng)的非印跡聚合物.

由表1可以看出,M2和N2、M3和N3、M4和N4這三組比例的聚合物,對DC的吸附量相近,而M1和N1對DC的吸附量差別較大,且其吸附量最大,對目標(biāo)分子印跡效果較好.因此,以下表征所用的印跡聚合物和空白聚合物是M1和N1.

2.2 MIP對DC的結(jié)合動力學(xué)

為了考察MIP對DC的結(jié)合速率,在5 mL濃度為5×10-5mol·L-1的DC溶液中,加入同樣量的MIP,分別在不同時間內(nèi)測定MIP對DC的結(jié)合量,結(jié)果如圖1所示.

從圖1動力學(xué)曲線中可以看到,在前20 min內(nèi)結(jié)合速率很快,而后趨向緩慢,1 h后結(jié)合量基本上達(dá)到平衡.MIP是具有立體孔穴結(jié)構(gòu)的高分子聚合物,可能會有深孔和淺孔存在.開始階段,由于是淺孔對模板分子結(jié)合,所以速率較快,淺層的孔穴飽和后,模板分子向深孔傳質(zhì)具有一定的位阻,以致結(jié)合速率下降[8].為保證MIP對DC充分結(jié)合,后續(xù)實(shí)驗中控制吸附時間為60 min.

表1 功能單體、交聯(lián)劑用量對MIP吸附量的影響Table 1 The influence of the amount of MAA and EGDMA to adsorption

2.3 MIP的結(jié)合等溫線

利用靜態(tài)結(jié)合實(shí)驗,來考察MIP對DC的吸附特性.根據(jù)其對不同初始濃度DC水溶液的吸附量Q,繪制吸附等溫線,如圖2所示.

圖1 MIP與DC的結(jié)合動力學(xué)曲線Fig.1 Curve of binding dynamics of MIP for DC

圖2 MIP(a)和NMIP(b)與DC的結(jié)合等溫線Fig.2 Binding isotherm of MIP(a)and NMIP(b)for DC

從圖2可以看出,隨著DC濃度的逐漸升高,MIP和NMIP對DC的吸附量都呈增大趨勢,但在所考察的濃度范圍內(nèi),MIP的吸附量明顯大于NMIP,且隨DC濃度的增大,二者吸附量的差別增大.說明NMIP

對DC的吸附主要是非特異性吸附,其吸附能力相對較弱;而 MIP包含有功能基固定排列的空穴,其大小和結(jié)構(gòu)與模板分子相互補(bǔ),這種空穴對印跡分子DC具有“記憶”功能,因而MIP對DC的吸附能力強(qiáng).

2.4 MIP的Scatchard分析

圖3 MIP的Scatchard曲線Fig.3 Scatchard plot of MIP

Scatchard模型被廣泛用來評價分子印跡聚合物的結(jié)合特性及識別機(jī)理[9],Scatchard方程可以描述為:

式中,Kd是結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù),Qmax是結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量,cDC是DC在濾液中的平衡濃度.將靜態(tài)結(jié)合實(shí)驗所得數(shù)據(jù)按(1)式作圖,可以得到Scatchard圖,如圖3所示.

由圖3可見,在 Scatchard圖中,Q/cDC與 Q是非線性關(guān)系,表明MIP的結(jié)合位點(diǎn)并不是等價的,但在圖的兩端呈兩個明顯的直線關(guān)系,這就說明了在所研究的DC濃度范圍內(nèi),MIP存在兩類不同的結(jié)合位點(diǎn).由Scatchard圖兩端直線的斜率和截距可以求得,高親合力的結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)為 Kd1=116.83μmol·L-1,最大表觀結(jié)合常數(shù)為 Qmax1=68.98μmol·g-1;低親合力結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)為 Kd2=12.75μmol·L-1,最大表觀結(jié)合常數(shù)為 Qmax2=15.13μmol·g-1.

2.5 MIP對DC的選擇性吸附

選擇與DC的官能團(tuán)和結(jié)構(gòu)相似的土霉素進(jìn)行結(jié)合試驗,以判定MIP和NMIP對DC的選擇性,類似物的結(jié)構(gòu)式如圖4所示,MIPs和NMIPs對DC和類似物的吸附量如表2所示.表2的 K為靜態(tài)吸附分配系數(shù).

式中cp表示底物在聚合物上的濃度(mg/g),cs表示底物在溶液中的濃度(mg/mL).

圖4 土霉素、鹽酸強(qiáng)力霉素的結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structures of oxytetracyline and doxycycline

表2 MIP及NMIP對不同物質(zhì)的吸附性能Table 2 Adsorption properties of tested substrates on MIP and NMIP

由表2可以看出,一方面MIP對DC的結(jié)合量遠(yuǎn)高于其對土霉素的結(jié)合量;另一方面,NMIP對DC的結(jié)合量明顯低于MIP,進(jìn)而說明在MIP中模板分子的印跡效應(yīng)發(fā)揮了重要作用,使得MIP對DC表現(xiàn)出高的選擇性.

結(jié)論:以DC為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑,合成了DC分子印跡聚合物.在水溶液中,利用靜態(tài)平衡結(jié)合法和Scatchard分析法證實(shí)了此印跡聚合物對DC具有高的選擇性吸附能力,可以將其用于固相萃取及液相色譜的固定相,為DC的過程監(jiān)測提供了新的選擇性富集材料.

[1]WHITCOMBE M J,RODRIBUEZ M E,VILLAR P,et al.A new method for the introduction of recognition site functionality into polymers prepared by molecular imprinting:synthesis and characterization of polymeric receptors for cholesterol[J].J Am Chem Soc,1995,117:7105-7116.

[2]TAKATERU M,TAKAYU KI H,TOSHIFUMI T.Surface plasmon resonance sensor for lysozyme based on molecularly imprinted thin films[J].Anal Chim Acta,2007,591(1):63-67.

[3]ESTHER T,ANTONIO M E,JOSéL T.Molecular imprinting-based separation methods for selective analysis of fluoroquinolones in soils[J].J Chromatogr A,2007,1172(2):97-104.

[4]CLAUDIO B,LAURA A,CRISTINA G.Solid phase extraction of food contaminants using molecular imprinted polymers[J].Anal Chim Acta,2007,591(1):29-39.

[5]方程,陳林,張悟銘,等.谷胱甘肽2Cu2+/PAn膜修飾電極的制備及表征[J].武漢大學(xué)學(xué)報,2003,49(6):689-692.

[6]郭洪聲,何錫文,鄧昌輝,等.藥物撲熱息痛分子模板聚合物的選擇性富集與識別特研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報,2000,21(3):366-366.

[7]周艷梅,李麗清,張成麗.以鋅原卟啉為功能單體的分子印跡聚合物對胞嘧啶的識別作用[J].化學(xué)研究,2007,18(4):59-61.

Synthesis of molecular imprinted polymers of doxycycline hydrochloride and their property in molecular recognition

DING Yan-ting1,ZHAN G Cheng-li2,ZHOU Yan-mei2＊,DOU Jun-chao2

(1.Basic Teaching Ex periment Center,Henan University,Kaif eng475004,Henan,China;
2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Henan University,Kaif eng475004,Henan,China)

O 632.5

A

1008-1011(2011)01-0088-04

2010-09-03.

2008年度河南省政府決策研究招標(biāo)課題(B153);河南省教育廳自然科學(xué)研究項目(2008B610001).

丁彥庭(1955-),女,高級實(shí)驗師,研究方向為光譜分析.＊

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