顧學(xué)文,肖 芹,王翠梅,陳月香,張真穩(wěn)

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,1.病理科;2.內(nèi)分泌科,江蘇揚(yáng)州,225001)

Epstein-Barr病毒(EBV)是一種DNA腫瘤病毒,與許多人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。已經(jīng)證實(shí)其與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān),如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金病,以及其他一些器官的淋巴上皮性腫瘤[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究顯示約10%的胃癌組織EBV陽(yáng)性,EBV感染與胃癌發(fā)生有相關(guān)性,但存在地區(qū)性差異[2]。胃癌是世界范圍內(nèi)死亡率居第2位的惡性腫瘤,在我國(guó)居各類(lèi)惡性腫瘤之首,其發(fā)生和發(fā)展涉及多種癌基因和抑癌基因激活和丟失。本研究旨在探討揚(yáng)州地區(qū)胃癌患者EBV感染與抑癌基因p53表達(dá)的相關(guān)性,并進(jìn)一步分析EBV致癌的可能機(jī)制,以期為臨床對(duì)EBV相關(guān)胃癌的預(yù)防、診斷、治療提供一定的理論依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

96例胃癌組織為本院2007年1月～12月外科手術(shù)切除標(biāo)本。其中男67例,女29例,年齡28～82歲,中位年齡51歲。其中高分化腺癌28例,中低分化腺癌47例,黏液腺癌 10例,黏液細(xì)胞癌11例。

1.2 試劑及實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原位雜交:采用荷蘭Pan Path公司生產(chǎn)的EBERl原位雜交試劑盒進(jìn)行原位雜交:石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,乙醇梯度水化,胃酶消化后,與地高辛標(biāo)記的EBER1寡核苷酸探針進(jìn)行變性、雜交反應(yīng),洗去剩余探針,用辣根酶標(biāo)記鼠抗地高辛抗體孵育,DAB液顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封固,鏡檢觀察。以EB病毒陽(yáng)性的鼻咽癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照,以已知EB病毒陽(yáng)性的鼻咽癌組織切片,將無(wú)探針雜交液替代EBER探針作為陰性對(duì)照。

1.2.2 免疫組化:全部標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛液固定,石蠟包埋,4 μ m厚連續(xù)切片。鼠抗人p53單克隆抗體購(gòu)自北京中山生物公司,EnVision試劑盒購(gòu)自DAKO公司。采用免疫組化EnVision兩步法,實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照,以PBS緩沖液取代一抗作陰性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判斷:原位雜交結(jié)果判斷:EBER1陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色,在核內(nèi)及核仁中均可見(jiàn)EBER1表達(dá),而EBER1陰性細(xì)胞不著色呈蘇木素復(fù)染的顏色。免疫組化染色結(jié)果判斷:細(xì)胞核中呈現(xiàn)均勻棕黃色顆粒分布判為陽(yáng)性;選取切片中陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)的10個(gè)視野,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的多少,分成-～ 級(jí),其中-:0;+:1%～25%;

:26%～50%; :51%～75%; :76%～100%。陰性結(jié)果不顯色,顯示復(fù)染的藍(lán)色。

2 結(jié) 果

2.1 EBERl原位雜交結(jié)果

EBERl陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色,陽(yáng)性信號(hào)幾乎表達(dá)在所有癌細(xì)胞中,陽(yáng)性細(xì)胞大多為+～ ,而EBERl陰性細(xì)胞不著色呈復(fù)染的藍(lán)色。96例胃癌癌組織標(biāo)本中檢測(cè)到15例EBER1陽(yáng)性,陽(yáng)性率為15.6%;15例陽(yáng)性標(biāo)本中男12例,女3例;有11例癌間質(zhì)中有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);陽(yáng)性標(biāo)本均為腺癌,其中高分化腺癌3例,中、低分化腺癌12例。印戒細(xì)胞癌及黏液腺癌未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。相應(yīng)癌旁組織均未檢測(cè)到EBV感染,2者EBER1陽(yáng)性率差異有顯著性(P<0.05)。提示EBV感染與胃癌的發(fā)生有關(guān),癌間質(zhì)中大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)可能是EB病毒感染的重要病理學(xué)特征。見(jiàn)圖1。

圖1 EB病毒在胃癌組織中彌漫陽(yáng)性,原位雜交法,DAB顯色 (200倍)

2.2 免疫組化染色結(jié)果

96例胃癌癌組織標(biāo)本中p53陽(yáng)性46例,陽(yáng)性率 47.9%(46/96),相應(yīng)癌旁組織均為陰性。胃癌組p53蛋白陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織組,兩組間有顯著性差異(P<0.01)。在15例EBV陽(yáng)性胃癌(EBVaGC)組織標(biāo)本中 p53陽(yáng)性11例,見(jiàn)圖 2,陽(yáng)性率 73.3%(11/15);81例EBV陰性(EBVnGC)組織標(biāo)本中p53陽(yáng)性35例,陽(yáng)性率43.2%(35/81);2組間有顯著性差異(P<0.01)。提示 EBV陽(yáng)性胃癌與p53蛋白表達(dá)有相關(guān)性。

圖2 EBVaGC組織中p53蛋白陽(yáng)性,EnVision免疫組化法 (200倍)

3 討 論

胃癌是本地區(qū)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)生與演變是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程,涉及多種原癌基因的激活及抑癌基因的失活。EB病毒是與人類(lèi)密切相關(guān)的病毒之一,幾乎所有的成人都被其感染過(guò),與人類(lèi)的許多惡性腫瘤有關(guān)[1]。EB病毒感染的細(xì)胞可表達(dá)EB病毒核抗原(EBNA s)、隱性膜蛋白(LMPs)和小分子non-polyadenylatedRNA s(EBER s)等[3-4]。其中由于EBER1在細(xì)胞核中表達(dá)豐富而穩(wěn)定,故是目前廣泛應(yīng)用的檢測(cè)EB病毒感染的敏感指標(biāo),并特別適于檢測(cè)石蠟包埋的病理切片。自1991年Shibata等[3]首次在胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)EBV以來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)EBV與胃癌相關(guān)研究逐漸增多,國(guó)外研究報(bào)道胃癌EBV感染檢出率7.3%～16.9%[3,5],國(guó)內(nèi)研究報(bào)道胃癌感染檢出率1.6～20.7%[6],存在明顯地區(qū)差異。本研究顯示本地區(qū)96例胃癌組織標(biāo)本,有15例癌組織EBERl陽(yáng)性,陽(yáng)性率為15.6%;而癌旁正常組織無(wú)EBERl表達(dá)。EBVaBC組織中幾乎所有癌細(xì)胞均有EBERl表達(dá),并有明顯的間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),均為普通型腺癌,表明感染EBV的瘤細(xì)胞為單克隆增生,從而推測(cè)EBV感染應(yīng)發(fā)生在胃癌形成早期,提示EBV感染與本地區(qū)部分胃癌的發(fā)生確實(shí)存在密切關(guān)系。同時(shí)間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)可能是 EB病毒感染的重要組織學(xué)特征之一。

Okano等[7]提出,經(jīng)過(guò)EBER1原位雜交技術(shù)證實(shí)胃癌細(xì)胞存在EBV者定義為EBVaGC。p53基因是一個(gè)廣譜的抑癌基因,大約50%的人類(lèi)腫瘤與p53基因的突變、過(guò)量表達(dá)或雜合性丟失有關(guān)。細(xì)胞周期失控是腫瘤發(fā)生的重要原因,p53基因在控制細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。突變型p53基因和蛋白構(gòu)型發(fā)生改變是腫瘤形成的關(guān)鍵。p53基因異常與胃黏膜細(xì)胞的癌變過(guò)程密切相關(guān)[8]。但EBVaGC中EBV與p53的相互作用尚無(wú)定論。EBV與癌基因和抑癌基因的相互作用成為EBV相關(guān)胃癌(EBVaGC)發(fā)生機(jī)制的研究熱點(diǎn)。癌基因和抑癌基因功能變化在EBVaGC發(fā)生發(fā)展中所起作用因EBV的參與而與其在EBV陰性胃癌(EBVnGC)中的作用有所不同[9],國(guó)內(nèi)學(xué)者高瑞萍等[10]采用PCRSSCP技術(shù)對(duì)胃癌組織標(biāo)本p53基因外顯子5-8的突變情況進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)EBV陽(yáng)性組p53基因突變率高于EBV陰性組,認(rèn)為EBV感染可能促進(jìn)了p53基因的突變和積累。李淑英等[11]報(bào)道EBV感染可能與p53基因表達(dá)呈正相關(guān)。Luo等[12]研究提出p53蛋白在瘤細(xì)胞中的累積可能是p53基因突變引起,也可能是野生型p53與EBV蛋白相互作用的結(jié)果。本研究,15例EBV陽(yáng)性組中有11例p53蛋白陽(yáng)性表達(dá),其陽(yáng)性率為73.3%,EBV陰性組中 p53蛋白陽(yáng)性率為43.2%,EBV陽(yáng)性組p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于EBV陰性組,提示EBV感染與p53蛋白在胃癌中過(guò)表達(dá)有明顯關(guān)系,可能對(duì)胃癌的發(fā)展起促進(jìn)作用。

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