朱春暉，謝 勇，呂農華

南昌大學第一附屬醫(yī)院消化研究所南昌330006

(2010-09-19收稿 責任編輯 趙秋民)

隨著生活水平的提高和飲食結構的改變，我國胰腺癌發(fā)病率逐年上升，3 a生存率不足10%，5 a生存率低于5%［1］。p53作為基因組衛(wèi)士，是目前已知的與腫瘤相關性最高的抑癌基因。2000年首次提出了 p53 基因 網(wǎng) 絡 的概 念［2］，p21waf1/cip1、bax、mdm2、puma及pten是該基因網(wǎng)絡中的關鍵基因，它們除了發(fā)揮各自的功能外，同時相互作用以調節(jié)細胞的正常生理活動。作者通過將野生型p53質粒導入胰腺癌sw1990細胞中，觀測細胞內調控基因的mRNA及蛋白表達情況，探討利用野生型p53質粒治療胰腺癌的可能性及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常胰腺組織6例，為江西省腫瘤醫(yī)院手術標本。獲取的每例標本快速置于冰上稱重，切割成100 mg左右的組織塊，分裝于液氮罐中保存，并送病理活檢，所有研究對象均簽署知情同意書。胰腺癌sw1990細胞株由上海第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院屠振興教授惠贈。重組質粒p53-GFP為美國印第安納大學盧華教授惠贈。LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)，質粒小提試劑盒(Tiangen公司)、Trizol、M-MLV、dNTP(Promega 公司)，各種抗體(Santa Cruz公司)，熒光試劑盒(Pierce公司)，DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，瓊脂糖(Amresco公司)，其余試劑為國產分析純。

1.2 sw1990細胞培養(yǎng) 使用含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)sw1990，0.5 g/L胰蛋白酶溶液消化貼壁生長的成纖維細胞并傳代［3］。

1.3 sw1990細 胞 和 正 常 胰 腺 組 織 中 p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten 及 mdm2 mRNA 表達的RT-PCR檢測 按Trizol試劑盒說明提取總RNA。PCR上下游引物序列見表1。PCR產物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。用 Bandscan圖像分析軟件進行吸光度積分值分析，以目的基因與βactin(內參照)的吸光度積分值之比作為各目的基因mRNA的相對表達量。

1.4 sw1990細胞和正常胰腺組織中 P53、BAX、PTEN及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表達的Western blot檢測 收集細胞和組織，提取蛋白并定量［4］。樣品經凝膠電泳分離，電轉移后，膜封閉 1 h，加入封閉液稀釋的一抗［一抗分別按1∶400(P53)、1∶400(BAX)、1∶200(PTEN)、1∶200(p-AKT)稀釋］，結合2 h。加封閉液稀釋的二抗［山羊抗鼠lgG(按1∶1 000稀釋);Actin山羊抗兔lgG(按1∶1 000稀釋)］，反應 1.5 h。ECL顯色，膠片曝光，顯影、定影，掃描，讀取各條帶的斑點密度值，獲得目的蛋白相對表達量。

1.5 重組質粒p53-GFP轉染sw1990細胞 將sw1990細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板內，每孔細胞數(shù)2×105個，加4 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)板孔內的細胞覆蓋率達70%時，于轉染前2 h吸出培養(yǎng)液，用PBS液洗滌細胞2次，每孔加入2 mL不含血清的DMEM液。分別將重組質粒p53-GFP及空白質粒pEGFP-N1溶于不含胎牛血清、不含抗生素的DMEM中，使其終濃度為25μmol/L，同時將10μL LipofectamineTM2000加入不含胎牛血清、不含抗生素的DMEM中，室溫孵育5 min后將質粒溶液加入，室溫孵育20～25 min后，將上述混合液分別加入各組培養(yǎng)孔內，2 mL/孔，輕搖混勻;空白組加入無質粒無脂質體且不含血清、不含抗生素的DMEM 2 mL，轉染后6 h，除去培養(yǎng)液，PBS液洗2遍，各孔加含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM 2 mL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，并收集成功轉染p53-GFP質粒并表達野生型P53的帶抗性基因的sw1990(sw1990/p53)細胞進行下列實驗。

表1 PCR上下游引物序列及反應條件

1.6 轉染細胞中 p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten和mdm2 mRNA及相應蛋白的表達 具體步驟同1.3 和 1.4。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0進行分析，應用兩獨立樣本的t或t’檢驗比較不同組別和因素中p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten 和 mdm2 mRNA 和相應蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 sw1990細胞與正常胰腺組織中增殖調控基因mRNA及相應蛋白的表達 見表2和表3。

2.2 穩(wěn)定轉染重組質粒p53-GFP的sw1990細胞及未處理細胞中增殖調控基因mRNA及相應蛋白的表達 見表4和表5。

表2 sw1990細胞與正常胰腺組織中p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten 和 mdm2 mRNA 的表達

表3 sw1990細胞與正常胰腺組織中 P53、BAX、PTEN、p-AKT 的表達

表4 轉染組與未處理組p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten 和 mdm2 mRNA 表達的比較

表5 轉染組與未處理組中P53、BAX、PTEN和p-AKT表達的比較

3 討論

正常情況下細胞的增殖和凋亡處于一個動態(tài)平衡，當細胞受到紫外線照射、離子輻射、化療藥物、蛋白激酶抑制劑及異常細胞生長信號等作用時，增殖凋亡相關基因表達失衡，信號傳導通路發(fā)生異常，細胞不受監(jiān)控地異常增殖并惡性轉化，導致腫瘤的發(fā)生。享有分子警察之稱的p53及其下游基因p21waf1/cip1、bax、puma、pten 及 mdm2 在其中發(fā)揮著重要作用。該實驗研究表明，與正常胰腺組織相比，sw1990細胞中 p53、p21waf1/cip1、bax、puma和 pten mRNA 低表達，mdm2 mRNA 高表達，與徐剛等［2］研究結果一致。

sw1990細胞穩(wěn)定轉染重組質粒p53-GFP后，上述基因mRNA及蛋白表達升高，說明外源性野生型p53導入后，P53聚集在細胞內并轉位至核，形成有生物學活性的四聚體，P53蛋白表達水平及其與DNA的親和力增高，并促進共激活因子的招募和組蛋白的乙?；?］。有活性的P53與靶基因的 P53反應元件結合，可激活包括細胞周期抑制蛋白(P21Wafl［5］、14-3-3 δ 以 及 BTG)、促 凋 亡 蛋 白(BAX［6］、APAFl［7］、PUMA［8-9］、P53AIPI［10］、PIDD［11］和NOXA［12］)及DNA修復相關蛋白(核苷酸還原酶P53R)在內的下游調節(jié)蛋白，從而引起細胞周期阻滯、生長增殖抑制。

p53能直接結合 pten的上游序列形成 P53/PTEN復合物，該復合物以一種不依賴磷酸酶活性的機制增強p53的轉錄活性及其蛋白穩(wěn)定性，從而延長P53的半衰期，使P53蛋白穩(wěn)定化［13-14］。與此同時，PTEN還能通過PI3K/Akt信號通路抑制Akt的活化，從而阻止MDM2 Ser166磷酸化及核轉位，并使之降解［15-16］;PTEN也可直接作用于 mdm2的啟動子抑制其基因轉錄，降低MDM2蛋白水平［17］。

總之，該實驗結果顯示，重組人野生型p53基因的導入可能通過調節(jié)相關基因的表達，從而抑制胰腺癌sw1990細胞的增殖，這為野生型p53基因治療胰腺癌提供了體外實驗依據(jù)。

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