賈莉婷，劉艷麗，馬葆靖，張 展，李肖甫，趙德華，張秋菊，郭瑞瑩，宋曉妍，榮守華

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院保健部鄭州450052

(2010-12-27收稿 責(zé)任編輯 趙秋民)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病率在育齡婦女中為5% ～10%［1］，發(fā)病機制至今尚未明確。現(xiàn)多采用動物模型［2-4］研究PCOS的病因、發(fā)病機制及臨床診斷和治療策略，但模型選擇的正確與否直接影響研究結(jié)果。來曲唑建模法和脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)建模法是國內(nèi)外使用較多的2種造模方法:來曲唑通過抑制雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的限速酶芳香化酶的活性，導(dǎo)致體內(nèi)雄激素的增高，動物選用6周齡SD雌鼠(相當(dāng)于女性育齡期);DHEA是膽固醇合成雄激素的中間產(chǎn)物，直接導(dǎo)致雄激素的水平增高，動物選用23日齡SD雌鼠(相當(dāng)于女性青春前期)。目前對PCOS模型的評價多限于動情周期、卵巢形態(tài)和組織學(xué)以及血清激素水平等幾個方面。作者采用來曲唑建模法和DHEA建模法，在上述評價指標(biāo)基礎(chǔ)上，加入雄激素受體(androgen receptor，AR)和黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)這2個指標(biāo)，評價2種模型的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 分別選用6周齡和23日齡清潔級SD雌性大鼠各60只，均采用隨機數(shù)字表分為實驗組、溶劑對照組和空白對照組，每組20只［購于河南省實驗動物中心，許可證號SCXK(豫)2005-0001］。清潔級飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～24℃，濕度40% ～60%，每天光照10 h，自由飲水，喂以顆粒飼料。

1.2 PCOS模型的建立

1.2.1 來曲唑法 將來曲唑溶于10 g/L羧甲基纖維素(CMC)中，實驗組大鼠灌胃來曲唑1 mg/(kg·d)，溶劑對照組灌胃10 g/L CMC，均于上午9時連續(xù)灌服21 d，空白對照組正常飼養(yǎng)。

1.2.2 DHEA法 將 DHEA溶于0.2 mL甘油中，實驗組大鼠皮下注射DHEA 60 mg/(kg·d)，溶劑對照組皮下注射0.2 mL甘油，均于上午10時連續(xù)皮下注射21 d，空白對照組正常飼養(yǎng)。

1.3 大鼠動情周期及體質(zhì)量檢測 每天對大鼠進行陰道涂片，巴氏染色后觀察動情周期的變化;每3 d測量大鼠的體質(zhì)量并記錄，繪制大鼠體質(zhì)量的增長變化曲線。

1.4 大鼠血清性激素，卵巢體積、相對質(zhì)量及組織學(xué)檢查 實驗組在最后一次應(yīng)用來曲唑和DHEA 24 h(并禁食12 h)后，對大鼠稱量后行乙醚麻醉，快速心臟取血法致死(對照組選取在動情間期)，取血清置－20℃凍存?zhèn)溆?，?yīng)用放射免疫法測定黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)和睪酮(T)，試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。取雙側(cè)卵巢，觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化、稱量，用游標(biāo)卡尺測量卵巢長、寬和厚度，計算卵巢體積［5］;根據(jù)大鼠體質(zhì)量和卵巢體質(zhì)量計算卵巢相對質(zhì)量［6］。一側(cè)卵巢置于體積分數(shù)為10%甲醛溶液中固定，另一側(cè)卵巢用PBS沖洗后－80℃凍存?zhèn)溆?。以卵巢最大平面作為待檢平面行石蠟包埋，每個石蠟塊分別以4μm厚度切片2次，行HE染色。

1.5 大鼠卵巢組織中AR、LHR蛋白的檢測 加入蛋白裂解液研磨大鼠卵巢組織，低溫高速離心后取上清，采用考馬斯亮藍染料結(jié)合法檢測蛋白濃度。100 g/L SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，經(jīng)20 V 1 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉。AR多克隆抗體(SC-816)、LHR多克隆抗體(SC-25828)均購自美國Santa Cruz公司，抗體均按1∶200稀釋;內(nèi)參為β-actin(購自北京博奧森生物公司)，抗體按1∶400稀釋。經(jīng)增強化學(xué)發(fā)光法顯影，用Biosens Digital System分析目的條帶灰度值，以目的條帶與β-actin灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6 大鼠卵巢組織中AR、LHR蛋白的定位 應(yīng)用SP法檢測卵巢組織中AR、LHR蛋白的定位表達，一抗同免疫印跡法，抗體按1∶100稀釋。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0進行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗分析各組大鼠實驗前后體質(zhì)量增加量、卵巢體積、卵巢相對質(zhì)量、血清性激素水平、AR和LHR蛋白相對表達量的差異，檢驗水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 PCOS模型大鼠動情周期觀察 來曲唑造模的實驗組大鼠在灌胃12 d后全部失去規(guī)律性動情周期，陰道涂片的細胞學(xué)特征為大量的白細胞，均處于動情間期時相;DHEA造模的實驗組大鼠動情周期變化極不規(guī)律;各對照組均保持規(guī)律的動情周期。

2.2 各組大鼠實驗前后體質(zhì)量增加量、卵巢體積和卵巢相對質(zhì)量比較 見表1。

表1 各組大鼠實驗前后體質(zhì)量增加量、卵巢體積和卵巢相對質(zhì)量比較

2.3 各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)、組織學(xué)觀察 來曲唑造模的實驗組大鼠卵巢表面較蒼白、包膜增厚，可見大量囊狀卵泡形成;DHEA造模的實驗組大鼠卵巢表面蒼白，囊狀卵泡凸起不明顯;各對照組大鼠卵巢紅潤。來曲唑造模的實驗組大鼠卵巢顆粒細胞層減至2～3層，間質(zhì)細胞增生明顯，卵泡內(nèi)卵母細胞多數(shù)缺失，稀見排卵前卵泡和黃體，可見大量囊狀擴張卵泡;DHEA造模的實驗組卵巢顆粒細胞層減少的程度沒有來曲唑造模的實驗組減少的顯著，白膜增厚和間質(zhì)增生不明顯;各對照組卵巢顆粒細胞呈多層，多為8～9層。見圖1。

2.4 各組大鼠血清性激素水平比較 見表2、3。

表2 來曲唑造模各組大鼠血清性激素水平比較

表3 DHEA造模各組大鼠血清性激素水平比較

2.5 大鼠卵巢組織中AR、LHR的表達情況 見圖2、3及表4。AR主要表達于卵巢顆粒細胞的胞核，呈棕黃色著色，2種造核方法的實驗組表達量高于對照組。LHR表達于卵巢顆粒細胞的胞質(zhì)及內(nèi)、外膜層細胞的胞質(zhì)，來曲唑造模的實驗組表達量高于對照組，DHEA造模的實驗組表達量略低于對照組。

圖2 各組大鼠卵巢組織AR(A)、LHR(B)的表達 (SP，×400)1:來曲唑造模的實驗組大鼠;2:DHEA造模的實驗組大鼠;3:對照組大鼠。

圖3 來曲唑法(上)和DHEA法(下)大鼠卵巢中AR、LHR表達的Western blot檢測A:實驗組;B:溶劑對照組;C:空白對照組。

表4 各組大鼠卵巢組織中AR、LHR蛋白相對表達量比較

3 討論

依據(jù)PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，結(jié)合該研究結(jié)果，從以下幾方面比較2種模型:來曲唑造模的實驗組每次所測定體質(zhì)量均大于對照組，且實驗組體質(zhì)量增長量明顯高于對照組，這與PCOS患者多表現(xiàn)肥胖相符;DHEA造模的實驗組大鼠體質(zhì)量增長量稍低于對照組，該法不適合于研究肥胖患者。2種方法造模的實驗組大鼠失去規(guī)律的動情周期，提示無排卵。2種造模方法大鼠卵巢均發(fā)生了多囊狀改變，來曲唑造模的實驗組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化較DHEA造模的實驗組大鼠更為典型，更適合于卵巢形態(tài)學(xué)的研究。

來曲唑和DHEA均可誘導(dǎo)一種高雄激素的狀態(tài)。來曲唑造模的實驗組大鼠P水平下降，提示不排卵，和人PCOS一致［7］。在PCOS中，血清LH升高是由P或E2所介導(dǎo)的LH負反饋［8］。來曲唑通過減少下丘腦-垂體軸E2的產(chǎn)生增強了LH分泌，是一種雙重效應(yīng)。PCOS患者血清LH、LH/FSH異常升高，促進卵泡內(nèi)膜細胞以及間質(zhì)細胞合成過多雄激素，導(dǎo)致竇卵泡募集亢進，最后卵泡發(fā)育停滯，來曲唑造模的實驗組充分證明了這點。但來曲唑造模的實驗組大鼠E2水平下降，不適合研究雌激素水平較高的PCOS;而DHEA造模的實驗組大鼠血清E2水平明顯增高，適合于雌激素水平較高的PCOS患者研究。

AR是一種配體依賴性的反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。PCOS病理狀態(tài)下，體內(nèi)的高雄激素環(huán)境可引起胞質(zhì)內(nèi)AR的核內(nèi)輸入，使核內(nèi)AR水平提高，與免疫組化結(jié)果一致。AR一旦被雄激素激活便能識別靶因子上專一的DNA序列并與之結(jié)合，從而調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄，表達新的蛋白質(zhì)，最終使得細胞的功能發(fā)生改變，靶器官卵巢則出現(xiàn)多囊狀卵泡的形成。2種造模方法的實驗組大鼠AR均高水平，表明高水平的T和AR結(jié)合后參與了多囊狀卵泡的形成。文獻［9-10］通過給雌性大鼠持續(xù)應(yīng)用來曲唑，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)排卵障礙、卵巢多囊樣變，卵巢中AR表達量增加，與該實驗結(jié)果相符。血清中LH與卵泡膜細胞LHR結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)而刺激甾體激素的合成，參與女性生殖過程，如受精卵著床、性腺發(fā)育及功能活動的調(diào)節(jié)。PCOS患者血清LH升高可通過誘導(dǎo)卵泡膜細胞表達LHR增加，LHR在PCOS患者卵泡顆粒細胞中表達增加可認為導(dǎo)致顆粒細胞發(fā)生分化、卵泡發(fā)育停滯，持續(xù)性無排卵的一個指標(biāo)。Jakimiuk等［11］報道PCOS患者的顆粒細胞和卵泡膜細胞中LHR mRNA的高表達，與作者的實驗結(jié)果相一致?？傊?，兩模型結(jié)果表明大鼠卵巢中AR、LHR參與了多囊狀卵巢形成，可作為PCOS模型蛋白質(zhì)水平的評價指標(biāo)。

綜上所述，無論從傳統(tǒng)的動情周期、解剖學(xué)、組織學(xué)、血清學(xué)等方面，還是從增加的蛋白質(zhì)水平比較，來曲唑造模法模型大鼠病理生理特征更接近于人類PCOS特征，是研究該病較為理想的動物模型，且較DHEA皮下注射法對大鼠創(chuàng)傷性小，操作簡便。

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