郝長付，張光輝，姚 武

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室鄭州450001

(2010-11-01收稿 責(zé)任編輯 徐春燕)

矽肺為塵肺中最常見的一種，主要是由于長期吸入含游離二氧化硅的粉塵，從而引起肺間質(zhì)纖維化及矽肺結(jié)節(jié)。矽肺的發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究［1］表明，二氧化硅刺激矽肺患者的肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)，通過介導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞(lung fibroblast，LF)活化與增殖，促進(jìn)膠原合成，參與矽肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，其中α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是LF激活的生物標(biāo)識。作者觀察了秋水仙堿對二氧化硅刺激AM引起的大鼠LF分泌α-SMA及膠原蛋白的影響，為矽肺的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 成年SPF級SD雄性大鼠由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，結(jié)晶型二氧化硅粉塵標(biāo)準(zhǔn)品由中國疾病預(yù)防控制中心勞動衛(wèi)生研究所研制(游離二氧化硅含量為99.8%，粒徑小于5μm的占95%以上)，秋水仙堿購自美國Sigma公司(純度在95%以上)，優(yōu)級胎牛血清購自杭州四季青生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，第一鏈cDNA合成試劑盒購自天根生化科技有限公司，大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原(COLⅠ、COLⅢ)酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海前塵生物有限公司，SYBR GreenⅠ購自廈門百維信生物科技有限公司。

1.2 游離二氧化硅粉塵工作液的配制 二氧化硅粉塵經(jīng)研磨、干燥、干熱滅菌(180℃，2 h)后，用無血清的DMEM培養(yǎng)基配成二氧化硅粉塵混懸液(100 mg/L)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 LF與肺AM的提取、純化 參照嚴(yán)玉蘭等［2］的方法提取和純化大鼠LF，應(yīng)用第5～10代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參照丁煥然等［3］的方法提取和純化大鼠肺AM。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 用無血清的二氧化硅培養(yǎng)基培養(yǎng)AM 24 h，離心收集培養(yǎng)液上清，加入秋水仙堿，使其終濃度分別為20、40和80μmol/L。大鼠LF分為秋水仙堿組、陽性對照組和陰性對照組，分別給予上述低、中、高濃度的秋水仙堿，含二氧化硅的AM培養(yǎng)液上清和不含二氧化硅的AM培養(yǎng)液上清，培養(yǎng)24 h。每組設(shè)3個(gè)平行樣。

1.5 各組LF α-SMA、COLⅠ及COLⅢ mRNA水平的測定 采用Trizol法提取各組LF的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用Real time-PCR法擴(kuò)增目的基因COLⅠ、COLⅢ、α-SMA。反應(yīng)體系:H2O211.7 μL，Taq PCR Mix 15 μL，上、下游引物各 0.8 μL，SYBR GreenⅠ 0.7 μL，cDNA 1.0 μL，共30 μL。α-SMA、COLⅠ和 COLⅢ反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，61℃退火45 s，72℃延伸45 min，40個(gè)循環(huán);72℃終延伸5 min。GAPDH反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán);72℃終延伸5 min。GAPDH、α-SMA、COLⅠ和COLⅢ引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。以陰性對照組靶基因的表達(dá)水平為參照，各秋水仙堿組及陽性對照組與其的比值為該組靶基因的相對表達(dá)水平。

表1 擴(kuò)增基因引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.6 各組LF培養(yǎng)液上清中COLⅠ、COLⅢ和總蛋白含量的測定 取各組LF的培養(yǎng)液上清，采用雙抗體夾心ABC-酶聯(lián)免疫吸附法測定COLⅠ、COLⅢ的含量，采用BradFord法測定樣品的蛋白質(zhì)濃度，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS 9.1進(jìn)行分析。對5組間α-SMA、COLⅠ、COLⅢ mRNA的表達(dá)水平及COLⅠ、COLⅢ和總蛋白含量行方差分析和Dunnett檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組LF α-SMA、COLⅠ和 COLⅢmRNA的表達(dá)水平 見表2。

表2 各組LFα-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA的表達(dá)水平

2.2 各組LF培養(yǎng)液上清中COLⅠ、COLⅢ和總蛋白含量比較 結(jié)果見表3。

表3 各組LF培養(yǎng)液上清中COLⅠ、COLⅢ和總蛋白的含量

3 討論

矽肺的主要特征之一是LF的擴(kuò)增和膠原的大量分泌。膠原在肺部大量沉積形成矽結(jié)節(jié)，在肺纖維化形成中起重要作用。Olbruck等［4］研究表明二氧化硅刺激AM分泌的大量的細(xì)胞因子促使LF活化，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原蛋白，并促進(jìn)其細(xì)胞的增殖，而COLⅢ、COLⅠ和α-SMA等表達(dá)上調(diào)是LF活化的重要表現(xiàn)。國內(nèi)研究［1］也表明，矽肺患者AM培養(yǎng)上清在促進(jìn)LF增殖的同時(shí)，促進(jìn)膠原合成與分泌，在肺纖維化進(jìn)程中，細(xì)胞外基質(zhì)主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。因此通過抑制LF增生或改變其生物學(xué)功能將有利于改善和減緩纖維化的發(fā)生發(fā)展。

秋水仙堿應(yīng)用于纖維化的治療已經(jīng)有很久的歷史，已知它能抑制纖維化進(jìn)展［5-6］。該研究結(jié)果示不同濃度秋水仙堿干預(yù)后，LF中COLⅠ、COLⅢ和α-SMA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，表明秋水仙堿抑制了LF的激活效應(yīng)，另外不同濃度的秋水仙堿干預(yù)后LF分泌的膠原蛋白和總蛋白均明顯減少，說明秋水仙堿能夠直接抑制LF分泌膠原蛋白從而達(dá)到減緩肺纖維化的進(jìn)程，這與以往的有關(guān)報(bào)道［7-8］一致。

綜上所述，秋水仙堿能抑制二氧化硅粉塵引起的LF的激活，減少其膠原蛋白的合成和分泌，最終達(dá)到抗纖維化的目的，從而為臨床上使用秋水仙堿防治矽肺進(jìn)展提供了理論依據(jù)。

［1］郝小惠，張麗，王獻(xiàn)華.二氧化硅刺激矽肺患者肺泡巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及對膠原合成分泌的影響［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2007，10(3):295

［2］嚴(yán)玉蘭，劉洋，步雪峰，等.鼠肺細(xì)胞的分離純化及原代培養(yǎng)［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，18(1):11

［3］丁煥然，馬小兵，戴麗琴.二氧化硅對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響［J］.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2007，33(4):214

［4］ Olbruck H，Seemayer NH，Voss B，et al.Supernatants from quartz dust treated human macrophages stimulate cell proliferation of different human lung cells as well as collagen-synthesis of human diploid lung fibroblasts in vitro［J］.Toxicol Lett，1998，96/97:85

［5］Antoniou KM，Nicholson AG，Dimadi M，et al.Long-term clinical effects of interferon gamma-1b and colchicine in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Eur Respir J，2006，28(3):496

［6］ Fiorucci E，Lucantoni G，Paone G，et al.Colchicine，cyclophosphamide and prednisone in the treatment of mildmoderate idiopathic pulmonary fibrosis:comparison of three currently available therapeutic regimens［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2008，12(2):105

［7］黃文彥，孫驊，潘曉勤，等.秋水仙堿對成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子以及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響［J］.中華兒科雜志，2004，42(7):524

［8］吳江鋒，張艷瓊，柳長柏，等.抗肝纖沖劑對肝纖維化小鼠Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，36(4):651