龔光明，秦 潔，軒小燕，杜 英，朱 沙，孫石磊，許予明

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科鄭州450052

(2010-11-06收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

自然發(fā)生的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+regulatory T cells，Tregs)通過抑制或影響CD4+和CD8+T淋巴細胞等的激活、擴增和(或)功能，在維持外周耐受和免疫系統(tǒng)平衡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最近研究［1］表明，γδT細胞也是Tregs直接調(diào)節(jié)的對象，Tregs對 γδT細胞有負(fù)調(diào)節(jié)作用［2-3］。γδT細胞只占T細胞總數(shù)的1% ～10%，其抗原識別受體(T cell receptor，TCR)由γ鏈和δ鏈組成，功能極為復(fù)雜并具有極強的可塑性。聯(lián)合應(yīng)用磷酸化抗原與IL-2可誘導(dǎo)靈長類動物Vγ2Vδ2 T細胞大量特異性擴增，這些擴增的細胞具有細胞毒性，并能特異性下調(diào)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量［4］。因此，將 Vγ2Vδ2 T細胞作為感染性疾病潛在的免疫治療工具或靶點，對難治性尤其是耐藥患者進行免疫治療，具有極大的實際應(yīng)用價值。靈長類非人動物因為具有和人類非常接近的生物學(xué)特征，成為研究人類感染性疾病的珍貴動物模型［4-5］。作者觀察了中國獼猴的 Tregs對 Vγ2Vδ2 T細胞體外增殖的調(diào)節(jié)作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 9只雄性中國獼猴(Rhesus macaques，RH)由美國芝加哥伊利諾伊州立大學(xué)生物資源中心提供。其中3只是無潛伏感染的正常動物，另6只3個月內(nèi)人工感染過卡介苗(BCG)。年齡3～6歲，體質(zhì)量3.1～6.9 kg。動物飼養(yǎng)和實驗方法均經(jīng)該校動物關(guān)懷與使用委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 抗體和試劑 ①純化鼠抗人CD28(CD28.2)、CD3(SP34)以及PE-Cy7和PB融合的CD3抗體(SP34-2)為BD Pharmingen公司產(chǎn)品，PB融合的鼠抗人CD4(OKT-4)、PE-Cy7融合的CD8(RPA-T8)、PE融合的CD25抗體(BC96)為eBioscience公司產(chǎn)品，純化或FITC融合的TCR Vγ2抗體(7A5)、純化或 FITC融合的TCR Vδ2抗體(15D)購自Endogen公司，APC/PE融合的山羊抗鼠 IgG單抗購自Biolegend公司。②CFSE細胞擴增試劑盒(C34554)購自Invitrogen/Molecular Probes公司，靈長類非人動物Tregs分離試劑盒(130-092-984)、Anti-mouse IgG磁珠、MACS MultiStand(130-042-303)、LD(130-042-901)和 MS(130-042-201)分離柱、MiniMACS(130-042-102)和MidiMACS(130-042-302)分離單位均為Miltenyi Biotec產(chǎn)品。重組人 IL-2(I7908)、PKH26紅熒光細胞著色盒(MINI 26)為Sigma/Aldrich產(chǎn)品。③磷酸化抗原 HMBPP［(E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl diphosphate-HMBPP］由德國 Reichenberg Armin實驗室提供。

1.2 實驗細胞的獲取及純化 ①外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs):采用密度梯度離心法從15 mL EDTA抗凝的中國獼猴外周血液中分離PBMCs。②Tregs:從PBMCs中陰性分選 CD4+T細胞，再從CD4+T細胞中分選CD4+CD25+T細胞。每次分選的CD4+CD25+T細胞的純度總是＞90%。具體分選方法參見試劑說明書。

1.3 Tregs對Vγ2Vδ2 T細胞增殖的影響 分離6只感染過BCG的中國獼猴的PBMCs，去除Tregs后以CFSE標(biāo)記，以2×105/孔接種96孔板，分4組，分別加入1∶8、1∶4、1∶2和1∶1比例的 PKH26標(biāo)記的Tregs;分別將HMBPP(終濃度150 nmol/L)、鼠抗人CD3和CD28單抗(終濃度5 mg/L，第0天加入)、IL-2(終濃度20 U/mL)加入相應(yīng)孔中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度下，以含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清、50 U/mL青霉素和50 mg/L鏈霉素的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)7 d后，收集細胞進行CD3、Vδ2熒光抗體染色，24 h內(nèi)上流式細胞儀(美國 DakoCytomation公司)檢測。用Summit V4.3(美國 DakoCytomation公司)分析CD4+T細胞的CFSE信號強度。分析時根據(jù)SSC/FSC和FSC/Pulse Width點陣對PBL設(shè)門，并排除掉PKH26+細胞的干擾。細胞擴增比例以CFSEdim細胞所占CFSE+細胞的百分比計算。

1.4 Tregs對IL-2聯(lián)合 HMBPP 預(yù)激活的 Vγ2δ2 T細胞增殖的影響 分離3只正常中國獼猴的PBMCs，去除Tregs后以CFSE標(biāo)記，以4×105/孔接種96孔板，每孔加入HMBPP(終濃度為150 nmol/L)和IL-2(終濃度20 U/mL)于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，第3天半量換液1次并維持IL-2終濃度為20 U/mL。培養(yǎng)5 d后，收集細胞并標(biāo)記CFSE，與當(dāng)天新鮮分離的同一動物的Tregs混合，加入IL-2繼續(xù)培養(yǎng)4 d。實驗第9天收集細胞，進行CD3、CD4及 Vδ2熒光抗體染色，24 h內(nèi)上流式細胞儀檢測(同1.3)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad軟件，應(yīng)用t’檢驗分析Tregs對HMBPP及CD3/CD28抗體誘導(dǎo)的Vγ2Vδ2 T細胞增殖的影響，應(yīng)用單因素方差分析比較Tregs對IL-2聯(lián)合 HMBPP誘導(dǎo)的 Vγ2Vδ2 T細胞增殖的影響，應(yīng)用析因設(shè)計的方差分析比較Tregs對IL-2聯(lián)合HMBPP預(yù)激活的Vγ2Vδ2細胞增殖的影響，檢驗水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 Tregs對 Vγ2Vδ2 T細胞增殖的影響 見表1、2。Tregs不僅抑制 Vγ2Vδ2 T 細胞的 HMBPP 抗原特異性擴增以及CD3/CD28抗體誘導(dǎo)的抗原非特異性擴增，還劑量依賴性抑制IL-2聯(lián)合HMBPP激活的Vγ2Vδ2 T細胞的擴增。

表1 Tregs對HMBPP及CD3/CD28抗體誘導(dǎo)的 Vγ2Vδ2 T細胞增殖的影響

表2 Tregs對IL-2聯(lián)合HMBPP誘導(dǎo)的Vγ2Vδ2 T細胞增殖的影響 %

2.2 Tregs對 IL-2聯(lián)合 HMBPP預(yù)激活的Vγ2Vδ2 T細胞增殖的影響 見表3。由表3可知，Tregs對IL-2聯(lián)合HMBPP預(yù)先激活的Vγ2Vδ2 T細胞的繼續(xù)擴增有抑制作用。

表3 Tregs對IL-2聯(lián)合HMBPP預(yù)激活的Vγ2Vδ2 T細胞增殖的影響(n=3) %

3 討論

已有較多的證據(jù)表明可利用Tregs作為免疫治療的工具治療腫瘤［6］、移植［7］和自身免疫?。?］，但其在病原性疾病中的應(yīng)用較少。大量研究［9-12］證實Tregs可控制多種病原的進展，比如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、結(jié)核分枝桿菌及真菌等。IL-17是招募中性粒細胞移行到肺部的主要細胞因子。研究［13］表明，在肺結(jié)核感染的早期，作為IL-17的主要產(chǎn)生細胞，γδT細胞參與中性粒細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，包括隨后肉芽腫的形成。

該研究結(jié)果顯示，中國獼猴Tregs對Vγ2Vδ2 T細胞有強大的體外抑制功能。Tregs不僅抑制CD3/CD28抗體誘導(dǎo)的抗原非特異性Vγ2Vδ2 T細胞的體外擴增，而且抑制HMBPP誘導(dǎo)的抗原特異性Vγ2Vδ2 T細胞的體外擴增。此外，Tregs以劑量依賴方式抑制IL-2聯(lián)合HMBPP誘導(dǎo)的正在進行中的Vγ2Vδ2 T細胞的體外擴增，并抑制被 IL-2聯(lián)合HMBPP預(yù)先誘導(dǎo)激活的 Vγ2Vδ2 T細胞的體外繼續(xù)擴增。這些證據(jù)表明，Tregs控制Vγ2Vδ2 T細胞介導(dǎo)的抗結(jié)核免疫［1］，對正在進行中的廣泛地抗結(jié)核感染免疫有強大的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Tregs可能被用來作為控制正在進行中的病原感染的特殊工具。已有報道［14］，使用 IL-2免疫毒素 Denileukin diftitox(一種IL-2和白喉毒素的融合蛋白)可以減少Tregs的數(shù)量，最終通過加強抗原特異性免疫反應(yīng)增強疫苗介導(dǎo)的T細胞免疫。

總之，對Tregs對Vγ2Vδ2 T細胞負(fù)調(diào)節(jié)作用的了解有利于準(zhǔn)確理解人類免疫系統(tǒng)清除各種病原或有害生物因子以維持免疫系統(tǒng)平衡的機制，以及應(yīng)用激活的Tregs和Vγ2Vδ2 T細胞治療感染、腫瘤或其他難治性疾病的相關(guān)機制。

［1］ Li L，Wu CY.CD4+CD25+Treg cells inhibit human memory gamma delta T cells to produce IFN-gamma in response to M.tuberculosis antigen ESAT-6［J］.Blood，2008，111(12):5629

［2］ Kunzmann V，Kimmel B，Herrmann T，et al.Inhibition of phosphoantigen-mediated gammadelta T-cell proliferation by CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells［J］.Immunology，2009，126(2):256

［3］ Mahan CS，Thomas JJ，Boom WH，et al.CD4+CD25(high)Foxp3+regulatory T cells downregulate human Vdelta2+T-lymphocyte function triggered by anti-CD3 or phosphoantigen［J］.Immunology，2009，127(3):398

［4］ Gong G，Shao L，Wang Y，et al.Phosphoantigen-activated V gamma 2V delta 2 T cells antagonize IL-2-induced CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells in mycobacterial infection［J］.Blood，2009，113(4):837

［5］ Shen Y，Zhou D，Qiu L，et al.Adaptive immune response of Vgamma2Vdelta2+T cells during mycobacterial infections［J］.Science，2002，295(5563):2255

［6］ Curiel TJ.Tregs and rethinking cancer immunotherapy［J］.J Clin Inves，2007，117(5):1167

［7］ Kang SM，Tang Q，Bluestone JA.CD4+CD25+regulatory T cells in transplantation:progress，challenges and prospects［J］.Am J Transplant，2007，7(6):1457

［8］ Verbsky JW.Therapeutic use of T regulatory cells［J］.Curr Opin Rheumato，2007，19(3):252

［9］ Barboza L，Salmen S，Goncalves L，et al.Antigen-induced regulatory T cells in HBV chronically infected patients［J］.Virology，2007，368(1):41

［10］Boettler T，Spangenberg HC，Neumann-Haefelin C，et al.T cells with a CD4+CD25+regulatory phenotype suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+T cells during chronic hepatitis C virus infection［J］.J Virol，2005，79(12):7860

［11］Chen X，Zhou B，Li M，et al.CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease［J］.Clin Immunol，2007，123(1):50

［12］Cavassani KA，Campanelli AP，Moreira AP，et al.Systemic and local characterization of regulatory T cells in a chronic fungal infection in humans［J］.JImmunol，2006，177(9):5811

［13］Umemura M，Yahagi A，Hamada S，et al.IL-17-mediated regulation of innate and acquired immune response against pulmonary mycobacterium bovis bacille calmette-guerin infection［J］.JImmunol，2007，178(6):3786

［14］Litzinger MT，F(xiàn)ernando R，Curiel TJ，et al.IL-2 immunotoxin denileukin diftitox reduces regulatory T cells and enhances vaccine-mediated T-cell immunity［J］.Blood，2007，110(9):3192