李雙鳳，冉 珂，王亞平，唐正國(guó)，肖艷英，王 丹

1)中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院麻醉科長(zhǎng)沙410011 2)長(zhǎng)沙市第三醫(yī)院麻醉科 長(zhǎng)沙410011

(2010-08-06收稿 責(zé)任編輯 趙秋民)

硫化氫(H2S)作為第三種氣體信號(hào)分子，近來(lái)在心血管系統(tǒng)中的價(jià)值備受關(guān)注，研究［1］發(fā)現(xiàn)H2S可減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，并能激活細(xì)胞信號(hào)通路［2］，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。H2S是至今發(fā)現(xiàn)惟一的內(nèi)源性血管平滑肌細(xì)胞線粒體敏感性鉀通道(mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mitoKATP)開(kāi) 放劑［3］。作者探討H2S預(yù)處理的延遲相對(duì)大鼠心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷的改善作用及mitoKATP對(duì)此作用的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 硫氫化鈉和mitoKATP阻滯劑5-羥葵酸(5-HD)均購(gòu)自美國(guó)Sigama公司，Bcl-2、Bax大鼠單抗IgG和辣根酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG購(gòu)自Santa Cruz公司，GAPDH大鼠單抗IgG購(gòu)自美國(guó)ProMab公司。

1.2 動(dòng)物分組 健康成年雄性SD大鼠(32只，體質(zhì)量300～320 g)由湖南斯萊景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，采用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為4組，每組8只。假手術(shù)組(Sham組):行冠脈穿線但不結(jié)扎;心肌缺血再灌注組(IR組):開(kāi)胸結(jié)扎左冠前降支(LAD)30 min，松解后再灌注2 h;H2S預(yù)處理組(H2S組):靜脈注射硫氫化鈉50μg/kg，24 h后同IR組處理;5-HD+H2S組(5-HD組):缺血前15 min靜脈注射5-HD(5 mg/kg)，其他同H2S組處理。

1.3 IR模型的建立［4-5］大鼠經(jīng)腹腔推注30 g/L戊巴比妥鈉麻醉(30 mg/kg)，多導(dǎo)聯(lián)心電監(jiān)測(cè)。氣管插管，動(dòng)物呼吸機(jī)控制呼吸，潮氣量8～10 mL/kg，頻率70 min－1。在心尖搏動(dòng)最明顯處之上一肋間隙開(kāi)胸，切開(kāi)心包，確認(rèn)左冠圓錐支，在圓錐支之后用7號(hào)絲線結(jié)扎LAD，立即可見(jiàn)左室前壁紫紺充血，心率減慢，血壓一過(guò)性下降，心電圖監(jiān)測(cè)ST段明顯抬高，確認(rèn)阻斷成功。

1.4 各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 在再灌注末通過(guò)頸靜脈注射氯化鉀0.1 g處死大鼠，每組取2只大鼠，剪取心臟，在冠脈結(jié)扎處下0.5 cm處剪取約1 mm3左心室組織，體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定2 h后，送湘雅醫(yī)學(xué)院超微病理室，經(jīng)清洗、固定、梯度脫水、包埋后，在80℃恒溫箱內(nèi)放置10 h聚合，修組織塊，做超薄切片，用醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色各10 min，用荷蘭FEITecnaiG212型透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，并拍片。

1.5 各組大鼠心肌Bcl-2及Bax蛋白的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［6］提取心肌蛋白。以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行蛋白半定量分析:取50μg蛋白質(zhì)樣品，加膜再生液煮沸變性后，進(jìn)行120 g/L SDSPAGE電泳;再電轉(zhuǎn)移至NC膜;用含5 g/L脫脂奶粉的PBS(pH 8.0)封閉2 h;分別加入適量Bcl-2或Bax大鼠單抗IgG(按1∶500稀釋)或大鼠GAPDH單抗IgG(按1∶8 000稀釋)，搖床上室溫反應(yīng)2 h;洗膜3次，20 min/次;加辣根酶標(biāo)記山羊抗大鼠 IgG(按1∶50 000稀釋)，室溫反應(yīng)2 h;洗膜后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光，X片曝光顯影;用Gel pro 4.0凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)其積分光密度(integrating optical density，IOD)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 H2S預(yù)處理對(duì)IR損傷大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 Sham組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常。IR組心肌肌原纖維排列紊亂、大面積斷裂、融合、消失，肌節(jié)結(jié)構(gòu)不清;線粒體形態(tài)異常，排列紊亂，腫脹，消失成空泡。H2S組心肌肌原纖維排列較整齊，肌節(jié)長(zhǎng)短較一致，明帶、暗帶仍可見(jiàn);線粒體輕度腫脹，膜較完整，少量融合形成空泡。與IR組相比，線粒體損傷程度明顯減輕。5-HD組與IR組差異不大(圖1)。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(—:2μm)A:Sham組;B:IR組;C:H2 S組;D:5-HD組。①:線粒體;②:肌原纖維;③:空泡。

2.2 H2S預(yù)處理對(duì)IR損傷大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖2、表1。

圖2 H 2 S預(yù)處理對(duì)IR損傷大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響

表1 H 2 S預(yù)處理對(duì)IR損傷大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響

3 討論

H2S在體內(nèi)可能存在2種形式，在pH值為7.4的生理?xiàng)l件下，以H2S和HS－2種形式形成一種動(dòng)態(tài)平衡，保證H2S在體內(nèi)的穩(wěn)定，維持內(nèi)環(huán)境pH值穩(wěn)定［7-8］。硫氫化鈉溶液與內(nèi)源性H2S的體內(nèi)存在方式相似，而且硫氫化鈉的濃度便于精確定量H2S含量，因此，硫氫化鈉溶液是較理想的外源性H2S供體。Elrod等［9］在大鼠IR時(shí)用10～500μg/kg的硫氫化鈉注入左心室進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)H2S呈劑量依賴(lài)性地保護(hù)左室功能，減少心肌梗死面積和炎癥反應(yīng)，減少線粒體損傷;而且發(fā)現(xiàn)50μg/kg硫氫化鈉為改善心肌IR損傷的最佳劑量。Pan等［10］通過(guò)比較硫氫化鈉延遲預(yù)處理與后處理2種方案，發(fā)現(xiàn)在心肌梗死前1 d給予單劑量硫氫化鈉比梗死后連續(xù)3 d給予能更好地保護(hù)心肌。因此，該實(shí)驗(yàn)采用劑量為50μg/kg的硫氫化鈉在缺血前24 h進(jìn)行延遲預(yù)處理方案。

Bcl-2家族分為抑凋亡基因(包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w 等)及促凋亡基因(包括 Bax、Bad、Bcl-xs等)。Hochhauser等［11］用轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)Bax高表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，且其表達(dá)的程度與心肌凋亡的程度呈正相關(guān)。Bcl-2和Bax以同源或異源二聚體形式發(fā)揮作用，當(dāng)Bax高表達(dá)時(shí)，形成同源二聚體Bax/Bcl-2促進(jìn)凋亡;Bcl-2高表達(dá)時(shí)，形成異源二聚體Bcl-2/Bax抑制凋亡發(fā)生。該研究結(jié)果表明硫氫化鈉作為H2S供體能夠降低心肌組織Bax的表達(dá)，提高Bcl-2表達(dá)，從而產(chǎn)生抗凋亡作用。IR引起心肌凋亡是導(dǎo)致移植心臟功能喪失的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)［12］。IR可引起大量自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體膜通透功能的改變，進(jìn)而引起線粒體途徑的凋亡。

作者的研究結(jié)果表明，給予5-HD后，H2S預(yù)處理減輕大鼠心肌IR損傷的效應(yīng)被取消，而且導(dǎo)致心肌組織中Bcl-2表達(dá)下調(diào)和Bax表達(dá)上調(diào)，提示激活mitoKATP后導(dǎo)致Bcl-2上調(diào)和Bax表達(dá)下調(diào)參與了H2S延遲預(yù)處理減輕大鼠心肌IR損傷的效應(yīng)。

通過(guò)電鏡觀察，IR預(yù)處理可減輕大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷程度，給予5-HD后，線粒體形態(tài)異常，排列紊亂，腫脹，消失成空泡，與IR組線粒體損傷程度相當(dāng)。這間接說(shuō)明激活mitoKATP參與了H2S的心肌線粒體保護(hù)功能。

總之，該實(shí)驗(yàn)表明H2S延遲預(yù)處理能夠減輕大鼠心臟IR損傷，這種改善作用可能與減少細(xì)胞凋亡及激活mitoKATP有關(guān)。但細(xì)胞損傷可能還存在不依賴(lài)mitoKATP的其他途徑，因此，H2S對(duì)心肌保護(hù)作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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