曹玉媛，張景亮，徐朝陽，程曉麗#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室鄭州450001 2)鄭州市精神防治醫(yī)院精神科鄭州450005

(2010-12-24收稿 責(zé)任編輯 趙秋民)

精神分裂癥(schizophrenia，SZ)是一種嚴(yán)重的全球性常見精神疾病，臨床表現(xiàn)為思維、情感、行為等多方面的障礙及精神活動不協(xié)調(diào)，個體終生患病率約為1.0%。SZ是一種多基因病，其遺傳度達80.0%，發(fā)病機制有神經(jīng)遞質(zhì)紊亂論、神經(jīng)發(fā)育障礙論和免疫論等［1］。新近 Doi等［2］和 Lauritzen 等［3］從不同的角度分別證實了線粒體在該病中的作用，且Jou等［4］認(rèn)為應(yīng)該把精神疾病當(dāng)作一種代謝病，建議以提升能量代謝、減少氧化應(yīng)激傷害為治療手段，至此，線粒體致病理論開始廣受關(guān)注，線粒體基因突變與精神類疾病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究也成為病因?qū)W研究的新熱點。線粒體 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)7445、5178 等位點與SZ發(fā)生關(guān)系的研究尚未見報道，作者以此為切入點進行研究，評價其在SZ發(fā)生中的作用，為SZ的診斷、治療及預(yù)防提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇河南漢族健康無關(guān)個體305例(對照組)，男162例，女143例，年齡19～55歲;296例散發(fā)SZ病例(患者組)，男158例，女138例，年齡18～54歲，根據(jù)《美國精神障礙診斷統(tǒng)計手冊》第3版修訂本(DSM-Ⅲ-R)標(biāo)準(zhǔn)確診為SZ患者，排除伴有嚴(yán)重軀體疾病和腦器質(zhì)性障礙的患者?；颊呋蚱浔O(jiān)護人及健康人均對該研究知情同意。

1.2 mtDNA 7445和5178位點突變分析 抽取研究對象外周靜脈血3～5 mL，EDTA抗凝，無菌管－20℃保存。采用標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿法抽提總DNA，752型分光光度計對DNA含量及純度進行測定。mtDNA 7445和5178位點引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成。mtDNA 7445上游引物序列:5’-CTTCCCACAACACTTTCTCGG-3’，下游引 物 序 列:5’-GTAAAGGATGCGTAGGGATG-3’;mtDNA 5178上游引物序列 5’-CTTAGCATACTCCT CAATACCC-3’，5’-CTGAATTCTTCGATAATGGCC CA-3’。PCR反應(yīng)體系為25μL;PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，退火溫度mtDNA 7445 59.9 ℃，mtDNA 5178 58.4 ℃ 30 s，72 ℃ 延伸30 s，共25個循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行限制性片段長度多態(tài)性分析。另取PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(Fermentas公司，酶切 mtDNA 7445)和 AluⅠ(Fermentas公司，酶切mtDNA 5178)分別對PCR產(chǎn)物進行消化，37℃4 h 15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，mtDNA 7445酶切后野生型mtDNA片段長度為400和262 bp，突變型為662 bp;mtDNA 5178酶切后野生型mtDNA片段長度358 bp，突變型為307和512 bp。

1.3 DNA序列測定 采用隨機數(shù)字表選取正常和突變個體各3例的PCR產(chǎn)物，由中美泰和生物技術(shù)公司進行純化測序。用Chromas讀取測序結(jié)果，Clustal X軟件進行多重序列完全比對，以mtDNA劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列為參照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0進行分析，應(yīng)用χ2檢驗分析2位點突變發(fā)生率的差異，檢驗水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

mtDNA 7445和5178位點的突變分析見圖1、2。2組中未見mtDNA 7445突變型存在;對照組中檢測出mtDNA 5178 C→A突變69例，SZ患者中檢測出 88例，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.931，P=0.047)。測序結(jié)果見圖 3，3 例 mtDNA 7445樣本測序結(jié)果均見正常XbaⅠ酶酶切識別序列，無突變存在。

3 討論

mtDNA突變能導(dǎo)致多種遺傳性疾病，累及高能耗的大腦、神經(jīng)、肌肉等不同組織器官，且同一突變可引發(fā)多種不同疾病，同一疾病又可由多種不同突變誘導(dǎo)。Chen等［5］研究發(fā)現(xiàn)mtDNA 7445位點可發(fā)生A→C或A→T突變。mtDNA 7445位點位于線粒體tRNAser(UCN)基因3’末端，是RNAseP剪切識別點，突變將影響基因的正常轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾等，最終影響線粒體自身多種蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細胞氧化磷酸化功能受損及ATP合成不足等。作者對296例SZ患者mtDNA 7445位點檢測未發(fā)現(xiàn)有突變存在，因此認(rèn)為其可能與SZ的發(fā)生無關(guān)，此結(jié)果有待于進一步擴大樣本量進行研究證實。

近來mtDNA 5178基因突變與各種疾病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究成為一個新的熱點，已發(fā)現(xiàn)mtDNA 5178位點可能與人類血脂、血壓及糖尿病等有一定關(guān)系［6］。Washizuka 等［7］對日本雙向情感障礙患者的研究認(rèn)為此位點突變是風(fēng)險因子。mtDNA 5178位點位于ND2基因上，ND2基因為線粒體電子呼吸鏈上復(fù)合體Ⅰ的編碼基因之一［8］。突變型(mtDNA 5178 A)可導(dǎo)致位于線粒體膜上NADH脫氫酶的第237位氨基酸位點發(fā)生亮氨酸到蛋氨酸的轉(zhuǎn)變。兩氨基酸含有不同的側(cè)鏈集團，前者具有脂肪族側(cè)鏈，后者則含甲硫集團。突變可影響NADH脫氫酶的生化特性，進一步影響糖代謝及氧化應(yīng)激水平。Kato等［9］研究發(fā)現(xiàn)mtDNA 5178 C→A與人格發(fā)育有關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)突變mtDNA 5178 A基因在SZ患者中占29.7%，而在對照組中占22.6%，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示mtDNA 5178A可能是SZ的風(fēng)險因素。

［1］張景亮，程曉麗，劉淑蓮，等.線粒體 DNA3243、3316、3394位點、突變與精神分裂癥相關(guān)分析［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2011，32(2):179

［2］ Doi N，Hoshi Y，Itokawa M，et al.Persistence criteria for susceptibility genes for schizophrenia:a discussion from an evolutionary viewpoint［J］.PLoSOne，2009，4(11):e7799

［3］ Lauritzen KH，Moldestad O，Eide L，et al.Mitochondrial DNA toxicity in forebrain neurons causes apoptosis，neurodegeneration，and impaired behavior［J］.Mol Cell Biol，2010，30(6):1357

［4］ Jou SH，Chiu NY，Liu CS.Mitochondrial dysfunction and psychiatric disorders［J］.Chang Gung Med J，2009，32(4):370

［5］ Chen J，Yuan H，Lu J，et al.Mutations at position 7445 in the precursor of mitochondrial tRNA(Ser(UCN))gene in three maternal Chinese pedigrees with sensorineural hearing loss［J］.Mitochondrion，2008，8(4):285

［6］Lal S，Madhavan M，Heng CK.The association of mitochondrial DNA 5178 C＞a polymorphism with plasma lipid levels among three ethnic groups［J］.Ann Hum Genet，2005，69(Pt 6):639

［7］ Washizuka S，Ikeda A，Kato N，et al.Possible relationship between mitochondrial DNA polymorphisms and lithium response in bipolar disorder［J］.Int J Neuropsychopharmacol，2003，6(4):421

［8］吳俊涵，劉書蓮，程曉麗，等.河南漢族精神分裂癥患者mtDNA5351位點突變與GRIK2基因兩位點多態(tài)性檢測［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2011，46(1):71

［9］ Kato C，Umekage T，Tochigi M，et al.Mitochondrial DNA polymorphisms and extraversion［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2004，128B(1):76