秦艷茹，喬俊靜，湯 虹，李芳芳，艾教育

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州450052 2)河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科鄭州450008

(2011-02-13收稿 責(zé)任編輯 姜春霞)

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一，它的發(fā)生發(fā)展是與遺傳因素、環(huán)境因素等多因素、多步驟相關(guān)的過程，在這個(gè)過程中可能涉及多個(gè)癌基因的激活和抑癌基因的失活。RAS相關(guān)區(qū)域家族1A(RASSF1A)基因是最近確定的一種候選抑癌基因，研究［1-2］表明，RASSF1A在正常組織中100%表達(dá)，而在許多腫瘤組織中存在較高的表達(dá)缺失，且RASSF1A在體外和體內(nèi)均能抑制腫瘤生長。目前對ESCC組織中RASSF1A基因的研究主要集中在RASSF1A的甲基化改變。該研究用免疫組化方法檢測組織芯片中245例ESCC組織和正常食管黏膜組織中RASSF1A蛋白的表達(dá)情況，以探究RASSF1A表達(dá)與ESCC發(fā)生發(fā)展和5 a生存率的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 ESCC組織及正常食管黏膜組織均取自河南省林州市人民醫(yī)院2001年至2007年存檔標(biāo)本。245例ESCC患者中男111例，女134例;年齡＜60歲131例，≥60歲114例;高分化28例，中分化163例，低分化54例;TNM分期(2002年AJCC分期)Ⅰ期13例，Ⅱ期148例，Ⅲ期84例;大體分型:髓質(zhì)型134例，潰瘍型71例，縮窄型15例，蕈傘型25例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移109例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移136例。正常食管黏膜組織201例?；颊咝g(shù)前均未接受任何放化療，所有標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性ESCC。

1.2 組織芯片制作 收集常規(guī)病理切片，在切片上根據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)確定具有代表性的腫瘤部位，用組織陣列儀(廣州浩翰儀器有限公司生產(chǎn))定位后，用穿刺取樣針在供體蠟塊相應(yīng)的位置進(jìn)行穿刺取樣。預(yù)先制備一個(gè)45 mm×20 mm大小的受體蠟塊，用穿刺取樣針打出間距為1.8 mm、直徑為1 mm、深度為3～4 mm的孔。然后，將穿刺所得的微小圓柱形組織擠壓到受體蠟塊上已制備好的陣列孔中。

1.3 2種食管組織中RASSF1A蛋白的檢測 采用ABC法。兔抗人RASSF1A單克隆抗體購自Ebioscience公司，ABC試劑盒購自Vector Laboratories公司，DAB底物試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，小牛凍干血清蛋白(BSA)購自美國Sigma公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作。一抗按1∶1 000稀釋，采用生產(chǎn)第二抗體的正常動(dòng)物血清封閉非特異性免疫球蛋白反應(yīng)與省略第一抗體作為空白對照，采用已知的陽性切片作陽性對照。陽性染色標(biāo)準(zhǔn):以胞質(zhì)出現(xiàn)黃棕色染色為陽性細(xì)胞，高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野，黃染細(xì)胞＞5%判為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較正常和ESCC組織、不同病理特征ESCC組織中RASSF1A蛋白陽性表達(dá)率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 正常食管黏膜和ESCC組織中RASSF1A蛋白表達(dá)情況 ESCC組織中RASSF1A蛋白陽性表達(dá)率為46.9%(115/245)，正常食管黏膜組織中為73.1%(147/201)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.263，P ＜0.001)。見圖1。

圖1 正常食管黏膜和ESCC組織中RASSF1A蛋白免疫組織化學(xué)染色(ABC，×100)A:正常食管黏膜組織;B:ESCC組織。

2.2 RASSF1A蛋白表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果見表1。

表1 RASSF1A蛋白表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 RASSF1A蛋白表達(dá)與ESCC患者5 a生存率的關(guān)系 RASSF1A蛋白陰性表達(dá)的ESCC患者的5 a生存率低于RASSF1A蛋白陽性表達(dá)的患者，見圖2。

圖2 RASSF1A陰性和陽性表達(dá)患者的5 a生存率曲線圖

3 討論

RASSF1A是Dammann等［3］2000年克隆出的候選抑癌基因，其cDNA序列中含有6個(gè)外顯子，共1 873 bp核苷酸，編碼含340個(gè)氨基酸的閱讀框架，產(chǎn)物為相對分子質(zhì)量38 800的蛋白質(zhì)。目前認(rèn)為，RASSF1A蛋白可能是一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要抑制蛋白，其通過多種途徑抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和衰老。RASSF1A蛋白表達(dá)缺失或降低可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

該研究發(fā)現(xiàn)，與正常食管黏膜組織相比，ESCC組織中RASSF1A蛋白陽性表達(dá)率降低;且與ESCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM臨床分期有關(guān)。這一結(jié)果說明RASSF1A陽性表達(dá)率降低導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)而影響預(yù)后;且可能參與了ESCC的發(fā)展過程，隨著腫瘤的進(jìn)展，RASSF1A的陽性表達(dá)率降低。推測可能通過以下機(jī)制發(fā)揮作用:①RASSF1A作為 Ras蛋白的效應(yīng)器，與凋亡前激酶 MTS1結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;RASSF1A陽性表達(dá)率降低可能破壞了Ras的平衡作用，使Ras更多發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞生長的作用，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生［4］。②RASSF1A可能通過微管結(jié)合中心體和紡錘體的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性;RASSF1A還能與CDC20相互作用，導(dǎo)致后期促進(jìn)復(fù)合物(APC)活性受到抑制，從而使細(xì)胞有絲分裂停滯在中后期［5］。③RASSF1A可以抑制CyclinD1的積聚，使細(xì)胞周期停滯在G1/S期，對細(xì)胞增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［6］。

該研究發(fā)現(xiàn)RASSF1A蛋白陰性表達(dá)的ESCC患者的5 a生存率低于陽性表達(dá)者，說明RASSF1A蛋白陰性表達(dá)的腫瘤比RASSF1A蛋白陽性表達(dá)的腫瘤更具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性，RASSF1A蛋白陰性表達(dá)對瘤細(xì)胞惡性侵襲的抑制作用減弱，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)而影響預(yù)后。

近來研究［7-8］證明，人類多數(shù)腫瘤組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島存在高頻率的甲基化，甲基化可能是RASSF1A基因失活的重要機(jī)制，與食管癌的發(fā)生也密切相關(guān)。由此作者推測，RASSF1A基因啟動(dòng)子的甲基化和缺失共同導(dǎo)致了ESCC的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，RASSF1A蛋白陰性表達(dá)與ESCC的預(yù)后密切相關(guān)，RASSF1A蛋白的表達(dá)異?？赡芘cESCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和5 a生存率有關(guān)。檢測RASSF1蛋白表達(dá)對ESCC的診斷有一定的臨床價(jià)值，并且可能作為ESCC患者預(yù)后判斷的標(biāo)志之一。

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