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(大連大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科，遼寧大連 116021)

脫乙酰殼聚糖-三氟乙酸對(duì)變異鏈球菌的體外抑菌效果

張?jiān)危愋《?/p>

(大連大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科，遼寧大連 116021)

［目的］探討脫乙酰殼聚糖-三氟乙酸(CS-TFA)復(fù)合物對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果。［方法］將CS-TFA與殼聚糖(CS)分別加入變異鏈球菌培養(yǎng)基，測(cè)定各自的最小抑菌濃度，以人工唾液作對(duì)照組。取96孔板，采用對(duì)倍稀釋方法用TPY液體培養(yǎng)基配制實(shí)驗(yàn)溶液，觀察三組溶液對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果。［結(jié)果］CS-TFA與CS的最小抑菌濃度分別為1.0 g/L與1.5 g/L，CS-TFA抑菌效果要優(yōu)于CS。［結(jié)論］CS-TFA對(duì)變異鏈球菌有一定的抑制作用。

脫乙酰殼聚糖-三氟乙酸;變異鏈球菌;抑菌

隨著氟化物應(yīng)用于防治齲病時(shí)間的延長(zhǎng)和研究的不斷深入，其使用顯示出越來越明顯的局限性。尋找安全、有效并且經(jīng)濟(jì)的防齲藥物成為齲病防治研究中的新熱點(diǎn)。殼聚糖(chitosan，CS)是甲殼素脫乙?；难苌铮亲匀唤缰形ㄒ坏膲A性多糖。獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)使其具有抑菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)組織再生等功能，用于齲病、牙周病的預(yù)防和治療，具有其它天然材料無法比擬的優(yōu)勢(shì)［1-3］。CS本身也有缺點(diǎn)，比如其水溶性較差，抑菌能力有限。因此，本實(shí)驗(yàn)采用將三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)與CS通過化學(xué)結(jié)合的方式合成含氟復(fù)合物脫乙酰殼聚糖-三氟乙酸(CS-TFA)，探討體外實(shí)驗(yàn)中CS-TFA對(duì)變異鏈球菌的抑菌特性。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)，COSTAR)，HTS7000Plus多孔板(紫外/熒光可見光)高效分析儀(美國(guó)PE公司)，去離子水(由Millipore純化系統(tǒng)提供)，TPY液體/固體培養(yǎng)基，CS(摩爾質(zhì)量為231 kg·mol/L，脫乙酰度90%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供)，TFA(天津塘沽鄧中化工廠，分析純)。

1.2 菌株及菌液制備

實(shí)驗(yàn)菌株為變異鏈球菌 (S.mutans)模式株ATCC25175;變異鏈球菌復(fù)蘇后接種于TPY瓊脂平板，37 ℃厭氧(80%N2，10%H2，10%CO2)培養(yǎng) 48 h，挑取單菌落劃線接種于TPY瓊脂平板，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于30 mLTPY液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，收集菌懸液，3500 r/min離心8 min，傾去上清液，細(xì)菌沉淀用TPY液體培養(yǎng)基洗2次后重懸于TPY液體培養(yǎng)基中，混勻，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值(A540)，用TPY液體培養(yǎng)基調(diào)整菌懸液吸光度A540=0.33，備用。

1.3 溶液制備

實(shí)驗(yàn)組:CS-TFA和CS。將質(zhì)量1 g的CS加入80 mL配制好的體積分?jǐn)?shù)2%的鹽酸溶液，攪拌使其充分溶解，往上述溶液中加入TFA(CS與TFA質(zhì)量比 1∶1)，加入0.75 g EDC.HCl，攪拌 12 h 后加入 0.75 g EDC.HCl，繼續(xù)攪拌 12 h 后，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3.5，通過透析和旋干，將所得產(chǎn)品放入60℃烘箱內(nèi)烘干，即得CS-TFA復(fù)合物。CS-TFA和CS樣品溶于1%(V/V)酷酸溶液，室溫下攪拌 2 h，調(diào) pH 值為 6.0，0.22 μm 的濾膜過濾后-20℃保存。

陰性對(duì)照組:人工唾液。采用ISO/TR 10271標(biāo)準(zhǔn)配制人工唾液:氯化鈣 0.4 g、氯化鉀 0.4 g、二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)0.795 g、二水磷酸氫鈉(NaH2PO4·2H2O)0.78 g、二水硫化鈉(Na2S·2H2O)0.005 g和尿素 1.0 g。去離子水稀釋至1 000 mL，用氫氧化鈣和硫酸調(diào)整pH值至6.0，測(cè)試溫度(37±1)℃，消毒備用。

1.4 抗菌實(shí)驗(yàn)

人工唾液采用對(duì)倍稀釋方法。用TPY液體培養(yǎng)基將藥物配制成梯度濃度的實(shí)驗(yàn)藥液，于37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h，取出肉眼觀察各孔中細(xì)菌生長(zhǎng)情況。通過離心(3500 r/min，離心8 min)，菌細(xì)胞用PBS緩沖液洗2次，PBS緩沖液重懸后，觀察實(shí)驗(yàn)組對(duì)變異鏈球菌的抑菌作用。將挑取菌液后的96孔板置多孔板高效分析儀上，測(cè)定各孔液體635 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。將經(jīng)離心、PBS洗菌和重懸的96孔板置多孔板高效分析儀上，在635 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值?！鰽=A測(cè)定-A陰性對(duì)照，根據(jù)測(cè)定的△A繪制折線圖。

在掃描電鏡下觀察正常條件下及CS-TFA抑菌作用下變異鏈球菌的形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

掃描電鏡下觀察正常條件下變異鏈球菌的形態(tài)呈串珠狀球菌，見圖1;CS-TFA對(duì)變異鏈球菌的抑菌圈清晰可見，見圖2。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CS濃度≥1.5 g/L時(shí)，抑制作用曲線低平，變異鏈球菌的生長(zhǎng)受到抑制;當(dāng)其濃度＜1.5 g/L時(shí)，隨著CS濃度的降低，對(duì)細(xì)菌的抑制作用逐漸減弱，抑制作用曲線呈上升趨勢(shì)，曲線的拐點(diǎn)在CS濃度為1.5 g/L處;當(dāng)CS-TFA濃度≥1.0 g/L時(shí)，抑制作用曲線低平，變異鏈球菌的生長(zhǎng)受到抑制;當(dāng)CS-TFA濃度 ＜1.0 g/L時(shí)，隨著 CS-TFA濃度的降低，對(duì)細(xì)菌的抑制作用逐漸減弱，抑制作用曲線呈上升趨勢(shì)，曲線的拐點(diǎn)在CS-TFA濃度為1.0 g/L 處(表1，圖3)。

表1 CS-TFA和CS在不同濃度下藥液的吸光度值Tab 1 Absorbance values of liquid of CS-TFA and the CS at different concentrations

圖3 兩種藥物對(duì)變異鏈球菌抑制作用的比較Fig 3 Comparison of two drugs inhibiting Streptococcus mutans

3 討 論

殼聚糖(CS)又名甲殼胺，是海洋甲殼類生物、昆蟲和其他無脊椎動(dòng)物外殼中的甲殼素［B-(1-4)聚-2-乙酰胺基-D-葡糖］的脫乙?；衔?，不溶于水，但可溶于某些酸。CS作為一種天然多糖，來源方便，易提取，無毒性，無刺激性，不致敏，不與體液發(fā)生反應(yīng)，可被機(jī)體的溶菌酶生物降解，故不存在任何生物學(xué)危害，有良好的生物相容性，是一種值得應(yīng)用的生物性制劑，其特有的生物粘附性，有助于抵御唾液的沖刷和稀釋，在齲病的預(yù)防和治療方面，具有巨大的應(yīng)用潛力［4］。

三氟乙酸(TFA)是一種含氟有機(jī)酸，它是許多有機(jī)化合物的良好溶劑，如與二硫化碳合用，可溶解蛋白質(zhì)。它也是有機(jī)反應(yīng)的優(yōu)良溶劑，是重要的有機(jī)合成試劑，由它可以合成各種含氟化合物。本實(shí)驗(yàn)CS-TFA為CS和TFA通過化學(xué)結(jié)合的方式合成，該復(fù)合物彌補(bǔ)了CS在抑菌中的不足。

以往更多的研究集中于CS的防齲功能。結(jié)果顯示，甲殼胺復(fù)合物對(duì)口腔致齲菌生長(zhǎng)、粘附和代謝產(chǎn)酸均有明顯的抑制，主要體現(xiàn)在干擾細(xì)菌代謝、抑制變形鏈球菌的粘附、發(fā)揮緩沖作用及調(diào)節(jié)菌斑pH等方面。CS可以有效抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)代謝，并增強(qiáng)唾液緩沖能力，提高菌斑pH值。0.5%CS可抑制變鏈菌對(duì)毛細(xì)管的粘附，并促使附著于粘附板上的變鏈菌脫落。在產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)中，0.5%CS可減少培養(yǎng)液終末pH下降和乳酸生成量［5］。

本研究結(jié)果顯示，CS對(duì)變異鏈球菌均有一定程度的抑制作用。隨著濃度的增加，抑菌作用增強(qiáng)，在高濃度時(shí)能完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。當(dāng)濃度為1.5 g/L時(shí)，變異鏈球菌受到明顯的抑制。CS-TFA對(duì)變異鏈球菌的抑菌作用規(guī)律與CS類似，而當(dāng)CSTFA濃度為1.0 g/L時(shí)對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)有完全的抑制作用。并且從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，CS-TFA的抑菌效果要略優(yōu)于CS。

CS-TFA復(fù)合物在抑菌作用中獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可能是未來一種非常有價(jià)值的抗齲藥物。本次實(shí)驗(yàn)只是初步的研究，需要今后對(duì)其抑菌機(jī)制、菌斑粘附性以及長(zhǎng)期防齲效果、臨床觀察等進(jìn)一步研究。

:

［1］Saranya N，Moorthi A，Saravanan S，et al.Chitosan and its derivatives for gene delivery［J］.Int J Biol Macromol，2011，48(2):234 -238.

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［3］Kang ML，Cho CS，Yoo HS.Application of chitosan microspheres for nasal delivery of vaccines［J］.Biotechnol Adv，2009，27(6):857 -865.

［4］No HK，Park NY，Lee SH，et al.Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights［J］.Int J Food Microbiol，2002，74(1 - 2):65 -67.

［5］陳薇，楊圣輝，果梅英.甲殼胺復(fù)合物影響變形鏈球菌生長(zhǎng)、代謝的實(shí)驗(yàn)室研究［J］.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，18(5):392-395.

Inhibitory effect of chitosan-trifluoroacetic acid complexes on streptococcus mutans in vitro

ZHANG Yuan-xin，CHEN Xiao-dong
(Department of Prosthodontics，the Affiliated Stomatology Hospital of Dalian University，Dalian116021，China)

Abstract:［Objective］To explore the effect of chitosan-trifluoroacetic acid(CS-TFA)complex on streptococcus mutans.［Methods］CS - TFA and CS were added to mediu of streptococcus mutans to determine the minimum inhibitory concentration，the artificial saliva was used as the control group，and the experiments were diluted with TPY liquid medium for preparation of the solution.［Results］The minimum inhibitory concentration of CS - TFA and CS are 1.0 g/L and 1.5 g/L，and the antibacterial effect of CS-TFA is better than that of CS.［Conclusion］CS-TFA has inhibitory effect in streptococcus mutans.

Key words:trifluoroacetic acid-chitosan;chitosan;streptococcus mutans;antibacterial

R781.1

A

1671-7295(2011)05-0441-03

2011-05-20;

2011-08-26

張?jiān)?1971-)，男，遼寧遼陽人，副教授。E-mail:yuanxinzhang2006@yahoo.com.cn

陳小冬，教授。E-mail:chenxd0111@sohu.com