于純淼，劉曉艷，張麗影，孟丹，國立東，于棟華

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱150030;2.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

天然綠色植物色素安全無毒，并且具有特有的營養(yǎng)價值和生理活性。丹參紅色素作為一種天然色素，是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取出來的脂溶性有效成分，為黃至深紅色混合物質［1］。丹參紅色素包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、二氫丹參酮等，均含有鄰醌或對醌的結構［2］，在生物體內(nèi)參與電子傳遞、機體的多種生物化學反應，對某些生化反應起促進或干擾作用，表現(xiàn)出抗癌［3］、抗菌［4］、抗病毒等多種藥理作用。其中丹參酮ⅡA具有天然抗氧化作用，臨床心血管藥理作用表現(xiàn)在抗動脈粥樣硬化、縮小心肌梗死面積、降低心肌耗氧量，對血栓形成以及血小板聚集功能有抑制作用，對多種腫瘤細胞具有殺傷、誘導分化和凋亡作用，并調(diào)節(jié)多種腫瘤相關基因的表達［5］。胃癌是我國常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率、死亡率在各種惡性腫瘤中居首位。丹參紅色素對人胃癌細胞作用的研究國內(nèi)外尚未見報道。我們在研究丹參紅色素金屬離子穩(wěn)定性的同時，以人胃癌細胞株SGC7901為觀察對象，研究丹參紅色素體外對胃癌細胞株SGC7901的抑制作用，以探討丹參紅色素的金屬離子穩(wěn)定性及其對人胃癌細胞SGC7901增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丹參根莖(購于寶豐醫(yī)藥有限公司);丹參酮IIA標準品由中國藥品生物制品檢定所提供;蒸餾水;無水乙醇、乙酸乙酯均為分析純。

1.2 儀器與設備

萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司);RE－52型旋轉蒸發(fā)儀(上海博通儀器設備有限公司);SHZ－3循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠);AL－104型精密電子天平(上海梅特勒－托利多儀器設備有限公司);KQ－500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UVmini－1240紫外可見分光光度計(日本島津);1640培養(yǎng)液(美國Hyclone);DMSO(天津市永大化學試劑開發(fā)中心);CO2細胞培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司);IMT－413倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS IMT－413);細胞培養(yǎng)瓶(Becton Dickinson);酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIO－RAD)。

1.3 實驗方法

1.3.1 色素試樣制備［6］

丹參→干燥→粉碎→溶劑提取→抽濾→濾液→減壓濃縮→浸膏→溶劑萃取→脂層→回收溶劑→重結晶→色素成品。

1.3.2 色素紫外可見吸收光譜及最大吸收波長的測定

將色素試樣配制成一定濃度的乙醇溶液，在300～700nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，以確認丹參紅色素的最大吸收波長。

1.3.3 丹參紅色素的金屬離子穩(wěn)定性研究［5，7］

精確稱取一定質量的丹參色素成品溶于50%乙醇中，配成一定濃度的色素溶液備用。按1∶3的比例將配制好的不同濃度的 Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+及Fe3+溶液加入備用色素溶液中，隔2天于最大吸收波長處測定吸光值。其中 Na+、K+離子濃度為0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L 及0.2mol/L;Mg2+濃度為 0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L;Ca2+濃度為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L;Fe3+的濃度為 0.05mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L;Cu2+濃度為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L。

1.3.4 丹參紅色素的抑癌性研究

采用四唑鹽(MTT)比色法測定細胞生長［8－9］:取對數(shù)生長期SGC7901細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔補足RP－MI1640培養(yǎng)液至180μl。37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。待細胞貼壁后換新培養(yǎng)基，實驗孔依次加入不同濃度丹參紅色素藥液各 20μl，藥物終濃度分別為 5、10、15、20μg/ml;對照孔中無水乙醇終濃度為2%;實驗組及對照組均設5個復孔。分別檢測丹參紅色素作用48h后對細胞生長的影響。于培養(yǎng)結束前4h，各培養(yǎng)孔加入10μl MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔內(nèi)加入150μl DMSO，振蕩15min使結晶充分溶解［8］。于酶標儀上讀取各孔光吸收值(A)，測量波長λ=492nm，參考波長 λ=620nm，按下式計算抑制率。

抑制率(%)=(1－實驗孔A均值/對照孔A均值)×100

2 結果與分析

2.1 丹參紅色素最大吸收波長的確定

將結晶純化后的丹參紅色素溶于無水乙醇中，配成一定濃度的丹參紅色素溶液，于紫外可見分光光度計上在300～700nm范圍內(nèi)進行掃描，以確定丹參紅色素－乙醇溶液的最大吸收波長。經(jīng)掃描，色素－乙醇溶液的最大吸收波長為450nm。

2.2 Na+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Na+對丹參紅色素穩(wěn)定性影響結果如圖1所示。圖1表明，添加了Na+的色素溶液放置18天之內(nèi)，與對照CK相比，Na+對丹參紅色素穩(wěn)定性影響不大。當色素溶液中Na+的濃度低于0.15mol/L時，色素溶液的吸光值低于對照CK，但隨著色素溶液中的的濃度由0.05mol/L增加到0.15mol/L時，色素吸光值有所增加;當色素溶液中Na+的濃度大于0.15mol/L時，色素的吸光值大于對照CK。由此可見，較高濃度的Na+對丹參紅色素具有一定的護色作用，而低濃度的Na+對丹參紅色素有一定的不良影響，原因有待進一步研究。

圖1 不同濃度Na+對色素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effects of Na+on the stability of the Salvia red pigment

2.3 K+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度K+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖2所示。由圖2可以看出，添加K+的色素溶液從開始即明顯高于對照CK。在放置18天之內(nèi)，添加K+的丹參紅色素溶液吸光度變化趨勢與對照CK相似，且隨著溶液中K+濃度的升高，色素溶液的吸光值就越大。由此可見，K+對丹參紅色素具有一定的增色作用，且K+濃度越高，增色作用越明顯。

圖2 不同濃度的K+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of K+on the stability of the Salvia red pigment

2.4 Mg2+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Mg2+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，剛加入Mg2+時，色素的吸光值明顯增大。隨著Mg2+濃度的增加，色素吸光值增加幅度也增大，但當濃度超過0.10mol/L時，色素溶液的吸光值又有所降低。從圖3還可以看出，添加Mg2+的丹參紅色素溶液在放置18天之內(nèi)，吸光值明顯大于對照CK。在0～12天時，對照CK和添加了Mg2+的色素溶液吸光值均呈現(xiàn)減小趨勢，添加了Mg2+的色素溶液吸光值降幅大于CK;在12～18天時，色素溶液吸光值又有所增加，可能是由于丹參紅色素中的一些單體結構發(fā)生了變化或相互發(fā)生了轉化［10］。

2.5 Ca2+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Ca2+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖4所示。由圖4可以看出，添加了Ca2+的丹參紅色素溶液在放置18天之內(nèi)，其吸光值明顯高于對照CK，這說明Ca2+對丹參紅色素具有一定的增色作用。在0～9天、12～18天，添加了Ca2+的丹參紅色素溶液其吸光值與CK呈現(xiàn)出了相反的變化趨勢;9～12天時吸光值變化趨勢相似。

2.6 Fe3+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Fe3+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖5所示。剛開始向色素溶液中加入Fe3+后，色素溶液色澤發(fā)生了變化，且隨著Fe3+濃度的增加，色素顏色逐漸由櫻紅色變成黑褐色，當濃度達到1mmol/L時，色素溶液還產(chǎn)生了黑色絮狀沉淀。由圖5可以看出，添加3種不同濃度的Fe3+－丹參紅色素溶液在放置18天之內(nèi)，其吸光度降幅均大于CK，且隨著Fe3+濃度的增加，色素溶液的吸光值越小。同時，隨著存放時間的延長，添加Fe3+的色素溶液的絮狀沉淀也逐漸增多。研究還發(fā)現(xiàn)，在0～6天，添加Fe3+的色素溶液吸光值下降，可能是由于Fe3+對色素的破壞作用;9～18天時色素溶液吸光值有所增加，可能是沉淀增加的原因。由此可見，F(xiàn)e3+對丹參紅色素有不良影響。

圖3 不同濃度的Mg2+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of Mg2+on the stability of the Salvia red pigment

圖4 不同濃度的Ca2+對色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of Ca2+on the stability of the Salvia red pigment

圖5 不同濃度的Fe3+對色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of Fe3+on the stability of the Salvia red pigment

2.7 Cu2+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Cu2+對丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖6所示。從圖6可以看出，當向丹參紅色素溶液中加入Cu2+后，溶液吸光值在逐漸增大，且Cu2+濃度越大，溶液的吸光值也越大。但在研究中發(fā)現(xiàn)，色素溶液在儲藏12天后，添加了10mmol/L Cu2+的色素溶液開始產(chǎn)生少量黑色沉淀;當色素溶液儲藏15天后，添加了5mmol/L Cu2+的色素溶液也開始出現(xiàn)少量黑色沉淀。由此可見，Cu2+對丹參紅色素有一定的不良影響。

圖6 不同濃度的Cu2+對色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of Cu2+on the stability of the Salvia red pigment

圖7 MTT比色法測定在48h后不同濃度丹參紅色素對細胞生長的抑制效應Fig.7 Inhibitory effect on the growth of cells in vitro measured by MTT colorimetric assay at different concentrations of the Salvia red pigment after 48h

2.8 丹參紅色素對SGC7901細胞增殖的影響［11－12］

不同濃度丹參紅色素對人胃癌細胞SGC7901細胞作用48h后的抑制效應如圖7所示。從圖7可以看出，當?shù)⒓t色素濃度為5mg/L時，對細胞抑制率約為32.3%;當?shù)⒓t色素濃度為15mg/L時，對細胞的抑制率達到了51.3%，抑制率相對增加了60%。由此可見，丹參紅色素對SGC7901具有極強的生長抑制作用，且隨色素濃度的提高，對細胞的抑制作用增強。當20mg/L丹參紅色素處理SGC7901細胞48h后，對細胞增殖抑制率達52.17%，相對濃度為15mg/L處理的細胞增殖抑制率僅增加了約2%。這說明，當?shù)⒓t色素濃度達到一定值時，隨色素濃度的提高，對細胞增殖抑制率的增加并不明顯，因此我們在實際應用中以15mg/L為佳。此外，丹參紅色素對SGC7901的增殖作用具有劑量依賴性，但是否具有時間依賴性還有待進一步研究。

3 結論

通過對丹參紅色素金屬離子穩(wěn)定性和抑癌性研究結果表明:1)常見金屬離子對丹參紅色素穩(wěn)定性影響不大。其中，K+、Ca2+和Mg2+在所研究的濃度范圍內(nèi)具有較好的增色或護色作用;而對于Na+來說，當Na+濃度在0.05～0.15mol/L范圍內(nèi)時，對色素穩(wěn)定性影響不大;當濃度達到0.2mol/L時，Na+對色素有增色作用。2)在所研究的濃度范圍內(nèi)，Cu2+雖也使色素溶液吸光值有所增加，但在儲藏一段時間后開始有黑色絮狀沉淀產(chǎn)生，這說明Cu2+對色素也具有一定的不良影響。3)當Fe3+與色素溶液混合時，色素溶液由紅色變?yōu)楹稚译S著溶液中Fe3+濃度的增大，溶液褐色加深并伴有黑色絮狀沉淀產(chǎn)生，由此可見，F(xiàn)e3+對色素具有較強的破壞作用。4)MTT結果顯示:5、10、15、20mg/L對人胃癌細胞SGC7901具有生長抑制作用，且呈現(xiàn)良好的劑量 －效應關系;但丹參紅色素對SGC7901是否具有時間依賴性還有待進一步研究。

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