徐西林，張曉峰，段洪超，孫輝，高鵬

(1.黑龍江中醫(yī)大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2黑龍江中醫(yī)大學，黑龍江哈爾濱150040)

股骨頭壞死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是由于各種病因使股骨頭的血液供應受到了破壞所造成的最終結(jié)果，一般認為不經(jīng)任何治療，可致使股骨頭承重部分塌陷，最后形成髖關節(jié)嚴重的功能障礙，是常見的致殘疾病之一。在疾病早中期重建股骨頭血運，促進壞死區(qū)的修復，防止股骨頭的塌陷，已成為ONFH治療的趨勢，本文通過活骨注射液關節(jié)腔注射對液氮冷凍法兔ONFH VEGF表達影響的實驗研究，探討中醫(yī)治療ONFH的新方法，取得了良好的療效，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制作 選用適齡新西蘭大白兔30只，體質(zhì)量2.2～2.5kg，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。用液氮冷凍法制造家兔模型，術(shù)后每天2次肌注青霉素20萬單位，預防感染，每天誘導動物爬坡喂食，在兔后肢負重狀態(tài)下驅(qū)趕動物3次。

1.2 動物分組與給藥方式 隨機分為模型組，給予生理鹽水髖關節(jié)腔注射治療;治療組，給予活骨注射液髖關節(jié)腔注射治療。造模后1周后處死動物6只，經(jīng)病理切片檢查證實造模成功后開始給藥。于1周及9周分批處死模型兔。

1.3 給藥劑量 活骨注射液髖關節(jié)腔內(nèi)注射劑量計算(現(xiàn)無國家規(guī)定的關節(jié)腔內(nèi)注射劑量換算公式，參照目前的動物實驗給藥方法、劑量、換算方法，采用自定關節(jié)腔內(nèi)注射劑量計算公式):動物與人等效劑量的換算公式，即:實驗動給藥劑量(ml/kg)=人的給藥劑量(ml/kg)×(實驗動物平均體重/人的平均體重)，得出每只模兔的給藥總劑量≈0.005 8ml/kg;同理得出對照組每只模兔的給藥總劑量≈0.005 8mg/kg。

1.4 檢測指標及檢測方法 采用RT－PCR法檢測VEGF mRNA表達情況。

2 方法與結(jié)果

2.1 RT－PCR 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄:取100mg碎裂股骨頭組織加入1ml Trizol(美國Invitrogen公司)，提取總RNA，按照試劑盒說明在20μl體系下完成逆轉(zhuǎn)錄。PCR引物序列:見表1。逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應體系為 20μl，42℃、60min→95℃、5min→4℃、5min。PCR反應體系為 50μl，按照:預變性，95℃、5min;變性，94℃、30s;退火 30s;延伸，72℃、30s;重復變性、退火、延伸，共35個循環(huán)，充分延伸，72℃、7min，結(jié)束溫度為4℃。擴增產(chǎn)物分析:取5μl產(chǎn)物在80V電壓下經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳50min，利用凝膠成像系統(tǒng)分析、掃描、拍照，獲取條帶平均密度和面積數(shù)據(jù)計算VEGF、β－actin的mRNA相對含量。GSR計算方法為:測得的目的基因的平均密度×面積/β－actin的平均密度×面積。

2.2 治療后VEGF表達情況的對比 結(jié)果見圖1。

表1 引物序列(使用Primer Premier 5.0軟件設計)

圖1 β－actin、VEGF表達

運用析因分析表明，治療組活骨注射液對ONFH治療過程中VEGFmRNA的表達有影響(P＜0.01)，具有統(tǒng)計學意義;治療時間對ONFH治療過程中VEGF mRNA的表達有影響(P＜0.05)，具有統(tǒng)計學意義。

3 討論

ONFH的基本病理特征是骨缺血導致的骨壞死。股骨頭壞死后再生血管穿透能力只有10～15mm，因此常遺留軟骨下骨壞死不能修復，此處易發(fā)生微骨折并逐漸形成硬化骨，又進一步擋住了新生血管進入，使壞死的自然修復更為困難。由于股骨頭自然修復過程緩慢，且壞死區(qū)只有部分能被修復，所以通過各種治療方法促進血管的再生進而促進骨組織的再生才有可能達到治療作用。在目前已知眾多具有促進血管再生功能的細胞因子中，VEGF是最強有力的一種血管生成因子，它通過與血管內(nèi)皮上的特異性受體結(jié)合，具有強大的促進血管生成的作用，而其他的促血管再生的細胞因子則是全部或者部分通過增強VEGF的表達來完成其作用的。研究表明:成熟的、已經(jīng)存在的血管對VEGF的依賴性不強;而新形成的血管的內(nèi)皮細胞則對VEGF具有強烈的依賴性，這種原因主要是由于外皮細胞的覆蓋所導致。

我們認為，在股骨頭缺血性壞死發(fā)病過程中，“血瘀”始終貫穿本病，即股骨頭缺血性壞死主要是以“血瘀”為主導或表現(xiàn)的病理過程?；钛鲈谥委煴静〉倪^程中有著重要的作用和功能，而活血化瘀中藥在治療股骨頭缺血壞死的過程中必定有其相應的作用對象，從而使壞死的骨組織修復?，F(xiàn)代研究認為，血管再生的過程適用于中醫(yī)學“生脈”的范疇，包括保持血管內(nèi)血流通暢，瘀阻、閉塞的血管出現(xiàn)再通，新的血管生成。因此，在股骨頭缺血性壞死發(fā)病過程中，骨壞死是由于瘀血阻滯引起，而新骨的再生必須在“生脈”的基礎上，瘀去則新生。然而活血化瘀中藥在這其中是通過何種機制產(chǎn)生作用的，這是現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點問題，對此進行研究，將有助于了解中藥治療ONFH的作用機理，探討中醫(yī)對本病治療的新方法。

活骨注射液是在對ONFH的發(fā)病機理認識的基礎上，依據(jù)“活血化瘀”的傳統(tǒng)中醫(yī)理論，從文獻中篩選具有代表性的、療效明確的且根據(jù)臨床經(jīng)驗，結(jié)合現(xiàn)代藥理研究成果，選取了以丹參等中藥制成的復合水針制劑?；罟亲⑸湟后y關節(jié)腔注射治療突破了傳統(tǒng)治療ONFH的中藥的劑型和給藥方式，既保留了中藥標本兼治的優(yōu)勢，又發(fā)揮了局部給藥的優(yōu)勢。以往臨床治療表明:活骨注射液髖關節(jié)腔內(nèi)注射治療可在短時間內(nèi)有效的改善ONFH的臨床癥狀，促進壞死骨的再生。本實驗研究結(jié)果表明，活骨注射液在ONFH治療1周后就可以促進VEGF表達上調(diào)，作用時間可以持續(xù)到9周以上?？梢?活骨注射液髖關節(jié)腔注射治療ONFH過程中，可以在長時間內(nèi)促進VEGF的高表達及血管再生，從而達到壞死骨修復的目的;活骨注射液髖關節(jié)腔注射治療ONFH疾病過程中，VEGF表達的持續(xù)時間及表達量要優(yōu)于ONFH自然修復過程，并有可能伴隨著壞死骨修復的全過程。