朱華旭， 黃 山， 陸文聰， 紐 冰， 郭立瑋*

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方分離工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210029;2．青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島266042;3．上海大學(xué)理學(xué)院，上海210029)

黃連解毒湯為唐·王燾所著《外臺(tái)秘要》中收藏的一首名方，由四味大苦大寒、瀉火解毒藥——黃連、黃柏、黃芩和梔子組成，方中以黃連為君，瀉心火、兼瀉中焦之火;黃芩為臣，瀉上焦之火;黃柏為佐，瀉下焦之火;梔子為使，通瀉三焦之火、導(dǎo)以下行。四藥合用，其瀉火解毒之效甚著，故適用于表里三焦火熱亢盛之證［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連解毒湯及其有效部位具有明顯的抗氧化、改善腦缺血和益智作用［2-3］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)黃連解毒湯化學(xué)成分的配伍變化進(jìn)行了深入的研究，由于全方酸性與堿性成分共存，湯劑在水煎煮過(guò)程中產(chǎn)生大量沉淀，從而造成后續(xù)精制分離工藝取舍較難。在前期的研究中，闡明了配伍提取時(shí)各指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率的變化［4］，并建立了全方水煎煮動(dòng)態(tài)提取過(guò)程中，方中指標(biāo)性成分——總生物堿、總黃酮、小檗堿、藥根堿、巴馬亭、黃芩苷和梔子苷隨時(shí)間變化的擬合方程［5］。

為了進(jìn)一步闡明成分組合的變化可能導(dǎo)致的藥效變化［6］，為該藥的臨床應(yīng)用與新劑型開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)選用藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)可用于工業(yè)化生產(chǎn)的膜分離和大孔吸附樹(shù)脂技術(shù)對(duì)黃連解毒湯進(jìn)行分離精制的有效性，采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，研究黃連解毒湯3種指標(biāo)性成分——小檗堿、黃芩苷、梔子苷的配比濃度與藥效作用的相關(guān)性，探討從黃連解毒湯“多元化學(xué)組成”與“多靶點(diǎn)作用機(jī)理”所表達(dá)的極其豐富的生物醫(yī)學(xué)信息中尋找蘊(yùn)藏其中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的方法［7］。

1 儀器、試劑和試藥

Agilent1100高效液相色譜(Agilent 1100四元泵;VWD檢測(cè)器;Agilent1100 LC色譜工作站);Nuair US Autoflow CO2Water-jacketed incubator;YJ超凈工作臺(tái)(蘇州市潔凈技術(shù)研究所);XSZ-DZ倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠);Spectramax 190酶標(biāo)儀(美國(guó)AD公司);96孔培養(yǎng)板購(gòu)自COSTA公司;1萬(wàn)分子量PS膜(廈門(mén)膜天膜科技有限公司);BT300-1F型蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司);AB-8型大孔吸附樹(shù)脂(河北滄州寶恩化工有限公司)。對(duì)照品(供定量測(cè)定用)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，鹽酸小檗堿、黃芩苷、梔子苷批號(hào)分別為110713-200208、110715-200212、110749-200511。

鼠性腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞細(xì)胞株由南京中醫(yī)藥大學(xué)陸茵教授惠贈(zèng)。DMSO(34869)、MTT(M2128)購(gòu)自Sigma公司;培養(yǎng)瓶(CORNING)、濾器(0．22μm)購(gòu)自 MILLIPORE公司;氯化鉀、過(guò)氧化氫、連二亞硫酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PBS實(shí)驗(yàn)室自制。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 黃連解毒湯全方水提液的制備 藥材黃連(產(chǎn)地四川)、黃柏(產(chǎn)地東北)、黃芩(產(chǎn)地甘肅)、梔子(產(chǎn)地江西)均購(gòu)自安徽亳州藥材公司，批號(hào)為090617。稱取藥材(黃連-黃芩-黃柏-梔子3∶2∶2∶3)0．6 kg，水煎煮2次，第一次10倍量水、第二次8倍量水，每次1．5 h;合并2次煎液，濃縮，得全方水提液(0．2 g 生藥/mL 的水提液)［7］。

2．2 黃連解毒湯各分離部位的制備 根據(jù)數(shù)學(xué)組合原理，黃連(君藥，A)、黃芩(臣藥，B)、黃柏(佐藥，C)、梔子(使藥，D)4 味藥組成 11 個(gè)組合［4］，分別為:全方組合(ABCD)、君臣藥組合(AB)、君佐藥組合(AC)、君使藥組合(AD)、君臣佐藥組合(ABC)、君臣使藥組合(ABD)、君佐使藥組合(ACD)、臣佐藥組合(BC)、臣使藥組合(BD)、臣佐使藥組合(BCD)、佐使藥組合(CD)，藥材按原方比例取樣1 000 g，以上述的水煎煮工藝提取，合并2次水提液并調(diào)整至0．25 g生藥/mL，再采用膜分離技術(shù)(1萬(wàn)分子量PS膜超濾液，工藝流程Ⅰ);樹(shù)脂吸附技術(shù)(以70%乙醇等洗脫，工藝流程Ⅱ);每組實(shí)驗(yàn)分別標(biāo)示為組合+工藝流程，共得到22個(gè)分離部位。

2．3 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn) 取各部位樣品，加1%DMSODPBS溶液配制成0．1 g生藥/mL，得 a組;依次稀釋，得1．0×10－2g生藥/mL(b組)，1．0 ×10－3g生藥/mL(c組)，1．0 ×10－4g生藥/mL(d 組)，1．0 ×10－5g生藥/mL(e組)，1．0 ×10－6g生藥/mL(f組)。將平均每孔3×104個(gè)PC12細(xì)胞種于96孔板中，以180μL(高糖 DMEM ∶小牛血清9∶1、雙抗100單位/mL)的培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，用DPBS液洗滌2次，再以160 μL(低糖DMEM、雙抗100單位/mL)為培養(yǎng)基，對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)、氯化鉀(KCl)、連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)誘導(dǎo)細(xì)胞缺糖缺氧損傷，依次加入各藥物濃度各20μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，以570和620 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定吸光度，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力［8］。計(jì)算出各組吸光度值的平均值(A)、SD值、保護(hù)率(B)，計(jì)算公式如下:

2．4 全方及各分離部位指標(biāo)性成分檢測(cè) 采用HPLC色譜法檢測(cè)各指標(biāo)性成分。色譜條件:色譜柱 Lichrospher C18柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm)(江蘇漢邦公司)，檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm(生物堿)、265 nm(梔子苷)、280 nm(黃芩苷);流動(dòng)相為梯度洗脫，A相為乙腈，B相為0．5%三乙胺(磷酸調(diào)pH3．1)，梯度為0～20 min 5%A～15%A，20～40 min 15%A～20%A，40～50min 20%A～30%A，50～55min 30%A ～5%A［4］。樣品制備方法為超聲提取［4］。

以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=4 ×107X+79 521，R=0．999 9，在0．006 44～0．413 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系;黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=3 ×107X+180 481，R=0．999 8，在0．013 0 ～0．835 mg/mL 之間呈良好的線性關(guān)系;梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=1 ×107X+37 266，R=0．999 9，在0．011 4～0．730 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。

3 數(shù)據(jù)挖掘

3．1 數(shù)據(jù)挖掘的目標(biāo) 研究不同分離方法所得黃連解毒湯分離部位中小檗堿量(以鹽酸小檗堿計(jì))、黃芩苷量、梔子苷量與細(xì)胞保護(hù)率之間的相關(guān)性，嘗試尋找黃連解毒湯中指標(biāo)性成分的最優(yōu)濃度配比。

3種指標(biāo)性成分量與不同細(xì)胞模型所得保護(hù)率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表1。

表1 黃連解毒湯全方及各分離部位指標(biāo)性成分量與保護(hù)率結(jié)果

3．2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以小檗堿、黃芩苷、梔子苷的濃度為目標(biāo)變量，通過(guò)數(shù)學(xué)建?？疾?種指標(biāo)性成分濃度與3種細(xì)胞模型保護(hù)率之間各自的定性和定量關(guān)系。經(jīng)計(jì)算后，初步判斷實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為非線性，故選用支持向量機(jī)(非線性方法)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［9-11］。在WINDOWS環(huán)境下，采用MASTER軟件計(jì)算得到3個(gè)非線性方程;方程雖然無(wú)法直觀地顯示各個(gè)變量與目標(biāo)參數(shù)之間的關(guān)系，但通過(guò)對(duì)變量和保護(hù)率進(jìn)行敏感性分析，得到指標(biāo)性成分濃度與保護(hù)率之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3．2．1 3種成分與過(guò)氧化氫致?lián)p傷保護(hù)率相關(guān)性考察 相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，其方程如下:

其中y為保護(hù)率，X為設(shè)定指標(biāo)性成分的濃度，Xi為在不用分離方法下得到的指標(biāo)性成分的濃度，βi為函數(shù)比例系數(shù)(計(jì)算參數(shù) c=300，ξ=0．05，δ =1)。

對(duì)變量和保護(hù)率進(jìn)行敏感性分析結(jié)果如下:當(dāng)小檗堿-黃芩苷-梔子苷的濃度比為1∶13∶12時(shí)，對(duì)過(guò)氧化氫致致細(xì)胞損傷的保護(hù)率最高。

3．2．2 3種成分與氯化鉀致?lián)p傷保護(hù)率相關(guān)性考察 相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，其方程如下:

其中y為保護(hù)率，X為設(shè)定指標(biāo)性成分的濃度，Xi為在不用分離方法下得到的指標(biāo)性成分的濃度，βi為函數(shù)比例系數(shù)(計(jì)算參數(shù) c=300，ξ=0．05，δ =1)。

對(duì)變量和保護(hù)率進(jìn)行敏感性分析未能得出對(duì)于氯化鉀致細(xì)胞損傷的保護(hù)率的最優(yōu)濃度。

3．2．3 3種成分與連二亞硫酸鈉致?lián)p傷保護(hù)率相關(guān)性考察 相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，其方程如下:

其中y為保護(hù)率，X為設(shè)定指標(biāo)性成分的濃度，Xi為在不用分離方法下得到的指標(biāo)性成分的濃度，βi為函數(shù)比例系數(shù)(計(jì)算參數(shù) c=300，ξ=0．05，δ =1)。

對(duì)變量和保護(hù)率進(jìn)行敏感性分析結(jié)果如下:小檗堿-黃芩苷-梔子苷的濃度比為13∶1∶3時(shí)，對(duì)連二亞硫酸鈉造模的保護(hù)率最高。

4 討論

3種損傷細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AC+Ⅰ、AC+Ⅱ、ABC+Ⅰ、ABC+Ⅱ、ACD+Ⅱ、ABD+Ⅰ、BCD+Ⅰ、ABCD+Ⅰ、ABCD+Ⅱ及全方對(duì)3種損傷模型均有保護(hù)作用，表明膜分離技術(shù)和大孔吸附樹(shù)脂技術(shù)可以有效地精制黃連解毒湯復(fù)方［12］。

采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，初步得到了3種成分對(duì)過(guò)氧化氫造模、對(duì)連亞硫酸鈉造模保護(hù)率的最佳濃度分別為小檗堿-黃芩苷-梔子苷為1∶13∶12與13∶1∶3;而對(duì)于氯化鉀造成的損傷，未能得出最優(yōu)濃度。對(duì)于指標(biāo)性成分的最優(yōu)配伍濃度，還需要進(jìn)行整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

支持向量機(jī)的數(shù)據(jù)挖掘方法可以作為黃連解毒湯有效部位物質(zhì)基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)處理手段。

［1］宋建芳，邊寶林，王宏潔．黃連解毒湯治療老年性癡呆藥理研究進(jìn)展［J］．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010，17(5):110-112．

［2］吳 彥，孫建寧，石任兵，等．黃連解毒湯有效部位對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載的作用及機(jī)制分析［J］．中國(guó)中藥雜志，2010，35(16):2166-2170．

［3］宋 玨，路 通，謝 林，等．黃連解毒湯抗氧化作用的血清藥理學(xué)研究［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(4):118-122．

［4］朱華旭，潘林梅，李 歡，等．黃連解毒湯全方與“組合-配伍”提取的比較研究［J］．中成藥，2010，32(10):1815-1818．

［5］潘林梅，傅 佳，朱華旭，等．黃連解毒湯提取動(dòng)態(tài)過(guò)程及沉淀產(chǎn)生機(jī)制的初步研究［J］．中國(guó)中藥雜志，2010，35(1):40-43．

［6］曹春林主編．中藥藥劑學(xué)［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1990:559-575．

［7］郭立瑋，潘林梅，朱華旭．中藥提取物伴生物質(zhì)的生物藥劑學(xué)特性及其制劑學(xué)意義［J］．中草藥，2007，38(9):1281-1286．

［8］Zheng Y，Cheng X R，Zhou W X，et al．Gene expression patterns of hippocampus and cerebral cortex of senescence-accelerated mouse treated with Huanglian Jiedu Decoction［J］．Neurosci Lett，2008，439(2):119-124．

［9］陸文聰，陳念貽，葉晨洲，等．支持向量機(jī)算法和軟件Chem SVM 介紹［J］．計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué)，2002，19(6):697-710．

［10］喬延江，李彭濤，蘇剛強(qiáng)，等．中藥(復(fù)方)KDD研究開(kāi)發(fā)的意義［J］．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，21(3):15-17．

［11］Trotter M，Buxton B，Holden S．Support vector machines in combinatorial chemistry［J］．Measurement and Control，2001，34(8):235-239．

［12］郭立瑋主編．中藥分離原理與技術(shù)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:237-364．