廖紫薇， 鄧紅霞， 張國(guó)平， 周 輝， 郭俊明

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室，浙江寧波315211)

全球每年死于癌癥的人數(shù)約為700萬(wàn)，其中因患胃癌死亡的人數(shù)比例約為十分之一;而在包括我國(guó)在內(nèi)的一些亞洲國(guó)家，胃癌的死亡率位居各種癌癥的首位[1]。雖然胃癌的診治技術(shù)發(fā)展很快，但人們對(duì)其發(fā)生機(jī)制尚未完全明了。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子。它們通過(guò)抑制翻譯或?qū)е耺RNA降解來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[2]。miRNA具有多樣的生物學(xué)功能，因而受到人們的廣泛關(guān)注[3]。越來(lái)越多的研究證明miRNA與腫瘤形成有密切關(guān)系，這使之成為腫瘤病理生理學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)之一[1]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，miR－106a在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織[3]。采用miR－106a抑制劑能有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖[4]。這些結(jié)果提示，miR－106a與胃癌發(fā)生的關(guān)系非常密切。為進(jìn)一步明確miR－106a的致癌特性，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR－106a類(lèi)似物到正常胃黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)以提高細(xì)胞內(nèi)miR－106a的水平，然后觀(guān)察其對(duì)正常細(xì)胞增殖的影響;另外，研究miR－106a抑制劑抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制并觀(guān)察裸鼠胃癌移植瘤的生長(zhǎng)變化。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES－1、胃癌MGC－803和SGC－7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。高糖型Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)液(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)購(gòu)自美國(guó)生命技術(shù)公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen。特級(jí)胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物制品公司，使用前56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體后分裝，－20℃保存。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)于上海生工生物工程公司。miR－106a類(lèi)似物(雙鏈)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，其序列為:5'－ AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG －3'，5'－ ACCUGCACUGCAAGCACUUUUUU －3'。miR －106a抑制劑和miRNA無(wú)關(guān)序列對(duì)照(陰性對(duì)照)同文獻(xiàn)[4]。PI/RNase Staining Buffer購(gòu)自BD。Western印跡實(shí)驗(yàn)的抗體購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)熱電公司)，Wellscan MKⅡ型酶標(biāo)儀(Labsystem)，熒光顯微鏡(Leica)，高速冷凍離心機(jī)(Heraeus)，Gel DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)和蛋白垂直電泳槽(Bio－Rad)，BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) GES－1、MGC－803和SGC－7901細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的GES－1、MGC－803和 SGC－7901細(xì)胞，以 1.5×104/well的密度分別接種至96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到50% －70%后，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)4 h后換新鮮培養(yǎng)液。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)本方法轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%[4]。

2.3 MTT法檢測(cè)miR－106a類(lèi)似物對(duì)正常胃黏膜上皮細(xì)胞增殖的影響 分別以0.5 μmol/L和1.0 μmol/L miR－106a類(lèi)似物處理細(xì)胞，每組6個(gè)復(fù)孔。然后于48 h和72 h用590 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(absorbance，A)值。各組取均值按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)率:相對(duì)增長(zhǎng)率 =(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組－1)× 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析miR－106a抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 用于細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)的胃癌MGC－803和SGC－7901細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞周期同步在G0/G1期;然后分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 0.5 μmol/L 和 1.0 μmol/L miR －106a抑制劑至細(xì)胞內(nèi)，每組3個(gè)復(fù)孔;24 h或48 h后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞;再用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清;加入冰預(yù)冷的70%乙醇固定，－20℃放置24 h后1 000 r/min離心5 min，棄去上清;再用PBS重懸細(xì)胞后，1 000 r/min離心5 min，棄去上清;最后加入 500 μL PI/RNase Staining Buffer避光染色20 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.5 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 0.5 μmol/L和 1.0 μmol/L miR－106a抑制劑至胃癌細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，并按照常規(guī)Western印跡方法檢測(cè)細(xì)胞周期素和細(xì)胞周期素依賴(lài)的蛋白激酶(cyclin－dependent kinase，CDK)表達(dá)水平的變化[5]。

2.6 裸鼠移植瘤模型觀(guān)察miR－106a抑制劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響 SPF雌性BALB/c近交系裸鼠(3周)購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)碼為SCXK(滬)2007－0005。裸鼠購(gòu)買(mǎi)后適應(yīng)性飼養(yǎng)2周開(kāi)始移植瘤實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)裸鼠(各18－20 g)分成3組，每組6只。先在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中對(duì)胃癌細(xì)胞MGC－803 分別轉(zhuǎn)染 1.0 μmol/L miRNA 陰性對(duì)照、0.5 μmol/L 和1.0 μmol/L miR －106a抑制劑。24 h 后用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS清洗2次。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，先用75%乙醇消毒裸鼠背部，然后用注射器將胃癌細(xì)胞(3×106/只)注射至背部皮下。從移植胃癌細(xì)胞的第26 d起每隔3 d測(cè)量腫瘤體積1次。腫瘤體積(V)的計(jì)算公式如下:V=W2× L ×0.5，其中W為腫瘤邊界最小值(cm)，L為腫瘤邊界的最大值(cm)。在第35 d時(shí)將裸鼠處死并測(cè)量移植瘤的質(zhì)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0分析，兩組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

結(jié) 果

1 MTT檢測(cè)結(jié)果

在倒置顯微鏡下可觀(guān)察到正常胃黏膜上皮GES－1細(xì)胞均勻貼壁生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染miR－106a類(lèi)似物的GES－1細(xì)胞生長(zhǎng)速度快于對(duì)照細(xì)胞，顯得較為致密。如圖1所示，脂質(zhì)體試劑組與空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度基本一致，2組的相對(duì)增值率無(wú)顯著差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用;而miR－106a類(lèi)似物對(duì)正常胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖呈濃度依賴(lài)性促進(jìn)作用。

Figure 1.Effect of miR－106a mimic on the growth of gastric mucous epithelial cells.Cells were treated with 0.5 μmol/L and 1.0 μmol/L miR － 106a mimic for 48 h and 72 h，respectively.±s.n=12.*P＜0.05，＊＊P＜ 0.01 vs control.圖1 miR－106a類(lèi)似物對(duì)正常胃黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2 細(xì)胞周期分析結(jié)果

從表1可知，miR－106a抑制劑使胃癌MGC－803細(xì)胞阻止在 G0/G1期(在 24 h和 48 h，0.5 μmol/L組和1.0 μmol/L組與對(duì)照組比較，均 P＜0.05)和 G2/M 期(在 24 h，1.0 μmol/L 組與對(duì)照組比較，P ＜0.01;在 48 h，0.5 μmol/L 組和 1.0 μmol/L組與對(duì)照組比較，均P＜0.05)。與MGC－803細(xì)胞不同的是，miR－106a抑制劑僅僅使SGC－7901細(xì)胞阻止在G2/M期(24 h時(shí)點(diǎn)，1.0 μmol/L組與對(duì)照組比較，P ＜0.05;48 h 時(shí)點(diǎn)，0.5 μmol/L 組和1.0 μmol/L組與對(duì)照組比較，均P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 miR－106a抑制劑對(duì)MGC－803細(xì)胞周期的影響Table 1.The effect of miR－106a inhibitor on cell cycle of MGC－803 cells(%.±s.n=3)

表1 miR－106a抑制劑對(duì)MGC－803細(xì)胞周期的影響Table 1.The effect of miR－106a inhibitor on cell cycle of MGC－803 cells(%.±s.n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

Time Group G0/G1 S G2/M 24 h Control 36.11±1.45 46.13±4.60 17.76±3.15 0.5 μmol/L miR －106a 43.08±0.88* 36.66±1.52 20.26±2.63 1.0 μmol/L miR －106a 41.02±3.45* 31.53±2.8127.45±4.23＊＊48 h Control 40.97±2.53 43.19±7.25 15.84±4.72 0.5 μmol/L miR －106a 47.51±0.62* 33.50±1.64 19.00±4.01*1.0 μmol/L miR －106a 45.38±1.48* 36.29±0.89 18.34±1.67*

表2 miR－106a抑制劑對(duì)SGC－7901細(xì)胞周期的影響Table 2.The effect of miR－106a inhibitor on cell cycle of SGC－7901 cells(%.±s.n=3)

表2 miR－106a抑制劑對(duì)SGC－7901細(xì)胞周期的影響Table 2.The effect of miR－106a inhibitor on cell cycle of SGC－7901 cells(%.±s.n=3)

*P ＜0.05 vs control.

Time Group G0/G1 S G2/M 24 h Control 57.40±0.36 29.00±0.70 13.60±1.07 0.5 μmol/L miR －106a 58.47±0.11 25.33±2.68 16.20±2.57 1.0 μmol/L miR －106a 57.00±0.89 26.36 ±2.50 16.64 ±2.30*48 h Control 46.02±1.52 27.99±5.03 25.99±3.60 0.5 μmol/L miR －106a 46.47±1.72 24.01 ±2.99 29.52 ±4.47*1.0 μmol/L miR －106a 46.92±3.36 24.63 ±2.21 28.45 ±2.26*

3 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化

結(jié)果顯示，miR－106a抑制劑主要影響CDK表達(dá)水平，而對(duì)細(xì)胞周期素表達(dá)的影響不明顯。在MGC－803 細(xì)胞中，經(jīng)0.5 μmol/L 和1.0 μmol/L miR －106a抑制劑處理，CDK1相對(duì)于對(duì)照分別減少了21.39%和24.93%;CDK2則分別減少了7.38%和29.70%，見(jiàn)圖2A。在SGC－7901細(xì)胞中，CDK1的表達(dá)也受到了抑制，經(jīng)0.5 μmol/L 和 1.0 μmol/L miR －106a 抑制劑處理，相對(duì)于對(duì)照分別減少了7.76%和8.15%，而對(duì)CDK2表達(dá)的影響不明顯，經(jīng) 0.5 μmol/L和 1.0 μmol/L miR－106a抑制劑處理，相對(duì)于對(duì)照分別僅減少了0.95%和1.02%，見(jiàn)圖2B。

4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，miR－106a抑制劑以劑量依賴(lài)性顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而細(xì)胞內(nèi)miR－106a水平較高的對(duì)照組則生長(zhǎng)較快(0.5 μmol/L組和1.0 μmol/L組與對(duì)照組比較，均P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The effects of miR －106a inhibitor on the expression of CDK1 and CDK2 analyzed by Western blotting.A:MGC－803 cells;B:SGC－7901 cells.±s.n=3.*P＜0.05 vs control.圖2 Western blotting分析miR－106a抑制劑對(duì)CDK1和CDK2表達(dá)的影響

Figure 3.The effect of miR－106a inhibitor on the growth of nude mouse xenograft tumor.The tumor volume was measured every 3 d from the 26th day on.±s.n=6.*P ＜0.05 vs control.圖3 miR－106a抑制劑對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

討 論

目前，有關(guān)miRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)引起了人們的重視。Petrocca等[6]發(fā)現(xiàn)，miR－106b－25基因簇既可與轉(zhuǎn)錄因子E2F1形成相互調(diào)節(jié)的環(huán)路又能通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β，TGF－β)而阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，從而共同抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本課題組在前期的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，miR－106a在胃癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織[3]。miR－106a的表達(dá)水平與腫瘤分期、大小和分化程度;淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;侵襲程度等密切相關(guān)[7]。尤其值得指出的是，我們還發(fā)現(xiàn)miR－106a在胃癌患者外周血中水平亦顯著高于常人水平[1]。這些結(jié)果說(shuō)明，miR －106a等miRNA在胃癌診斷中具有一定價(jià)值。為說(shuō)明miR－106a在胃癌發(fā)生中具有促癌作用，我們采用miRNA抑制劑下調(diào)胃癌SGC－7901和MGC－803細(xì)胞內(nèi)miR－106a的水平，結(jié)果顯示，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR－106a水平后，胃癌細(xì)胞的增殖明顯受到抑制[4]。

為了解miR－106a影響細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，我們觀(guān)察了下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR－106a水平后，2種胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期的變化。研究結(jié)果顯示，miR－106a抑制劑使胃癌MGC－803細(xì)胞阻止在G0/G1期和G2/M期，而使胃癌SGC－7901細(xì)胞阻止在G2/M期(表1、2)。相對(duì)于 SGC－7901細(xì)胞，miR－106a抑制劑對(duì)MGC－803細(xì)胞的細(xì)胞周期影響程度更大些。我們注意到，SGC－7901細(xì)胞的分化程度比MGC－803的要高，它們分別是中分化和低分化胃癌細(xì)胞株[5];而胃癌臨床組織標(biāo)本中miR－106a表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，它的表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞的分化程度呈負(fù)相關(guān)[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果正好說(shuō)明了miR－106a與胃癌細(xì)胞的分化程度有密切關(guān)系。

為了進(jìn)一步探尋miR－106a影響細(xì)胞周期的機(jī)制，我們采用Western印跡技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR－106a抑制劑下調(diào)了胃癌細(xì)胞內(nèi)CDK1和/或CDK2的表達(dá)(圖2)。在細(xì)胞周期從G1向S期轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，CDK1發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8];CDK1與其它細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子(如細(xì)胞周期素B)結(jié)合形成的復(fù)合體還能調(diào)節(jié)G2向M期轉(zhuǎn)化[9]。CDK2在G1和S期均具有調(diào)節(jié)作用，是影響細(xì)胞從G1進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)控因子[10]。如圖2結(jié)果顯示，miR－106a抑制劑使胃癌MGC－803細(xì)胞的CDK1和CDK2的表達(dá)均受到抑制;而對(duì)SGC－7901細(xì)胞而言，miR－106a抑制劑主要抑制了CDK1的表達(dá)，而對(duì)CDK2表達(dá)的影響不明顯(圖2B)。這些結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的細(xì)胞周期變化是一致的，即:miR－106a抑制劑使MGC－803細(xì)胞阻止于G0/G1期和G2/M期，而僅使SGC－7901阻止于G2/M期(表1、2)。上述結(jié)果表明，下調(diào)胃癌細(xì)胞內(nèi)miR－106a的水平可影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而進(jìn)一步干擾細(xì)胞周期的進(jìn)程，并參與了抑制細(xì)胞增殖的過(guò)程。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明，通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)miR－106a的水平能有效抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖3)。

為進(jìn)一步證明miR－106a具有致癌特性，本研究還以正常胃黏膜上皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)導(dǎo)入miRNA類(lèi)似物以提高其在細(xì)胞內(nèi)的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR－106a可以促進(jìn)正常細(xì)胞的增殖(圖1)。目前國(guó)內(nèi)外研究miRNA的致瘤特性大多數(shù)采用癌細(xì)胞作為材料[11，12]，而本研究以正常細(xì)胞作為材料，從另一角度說(shuō)明miR－106a確實(shí)有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。這種研究思路有助于較全面地揭示miRNA與癌癥的關(guān)系，值得借鑒。

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