劉玉暉， 游 宇

(1江西中醫(yī)學院藥學院藥理學教研室，江西南昌330004;2南昌大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，江西南昌330006)

流行病學研究證明，高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血癥是人類許多疾病的獨立危險因素，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦中風、外周血管栓塞性疾病等[1，2]。正常情況下，Hcy在甲硫氨酸合酶或甜菜堿－Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?，或在胱硫?β－合成酶(cystathionine β－synthetase)和維生素B6作用下，通過轉(zhuǎn)硫過程分解為胱硫醚，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?。如果遺傳性地缺少關(guān)鍵酶以及維生素B12等維生素時，Hcy不能進行正常的轉(zhuǎn)化與代謝，而是在氨?；鵷RNA合成酶(aminoacyl－tRNA synthetases，AARSs)作用下，進行分子內(nèi)的反應(yīng)，Hcy側(cè)鏈的巰基與羧基反應(yīng)，形成Hcy硫內(nèi)酯 (homocysteine thiolactone，HTL)[3]。 目 前 對 于HTL引起細胞損傷的機制尚不清楚，推測可能與誘導活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的形成有關(guān)。血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)不僅是血液與血管平滑肌之間的生理屏障，也是一個高度活躍的代謝庫，它可以合成多種活性物質(zhì)，如一氧化氮(nitro oxide，NO)、內(nèi)皮素、緩激肽等，在調(diào)節(jié)血管的舒縮活動與血液的流動性方面起著十分重要的作用[4]。高Hcy血癥可引起血管功能損傷和動脈粥樣硬化的發(fā)生，Hcy的致病作用主要與Hcy在體內(nèi)生成了HTL有關(guān)。本實驗利用培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模型，觀察HTL對內(nèi)皮細胞的直接損傷作用，旨在從細胞和分子水平探討HTL損傷內(nèi)皮細胞的機制，尋找其干預靶點，探索治療途徑。

材料和方法

1 試劑與儀器

HTL、NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素(apocynin，Apo)、NF－κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)、胰蛋白酶和 DMSO(Sigma)。DMEM培養(yǎng)基(Gibco)。小牛血清(杭州四季青公司)。HUVECs細胞株從北京協(xié)和醫(yī)科大學腫瘤研究所購買(來源于美國ATCC細胞庫，屬于正常的 HUVECs，vWF抗原陽性，編號 CRL－2480，具有貼壁生長、接觸抑制、密度依賴性等生物學特征)。NO試劑盒、NF－κB活性試劑盒、ROS檢測試劑盒和MTT細胞增殖檢測試劑盒和BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。Anti－IκBα(BioLegend)。TNF－α和sICAM－1的ELISA試劑盒(ADL)。抗氧化劑N－乙酰半胱氨酸(N－acetyl cysteine，NAC，碧云天生物技術(shù)研究所)。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

DMEM用純化水溶解，NaHCO3調(diào)pH值至7.2－7.4，濾過除菌后4℃保存。小牛血清56℃，30 min滅活補體后分裝，－20℃凍存。臨用時培養(yǎng)基加入相應(yīng)量的小牛血清與青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)。

UV755B型紫外分光光度計(上海儀器廠)、CO2培養(yǎng)箱(FORMA311，上海瑞仰凈化裝備有限公司)、IX70型倒置相差顯微鏡(Olympus)、IJ－6A低溫離心機(Beckman)、Eppendorf離心機(Eppendorf)、Model 3.9 EL酶標儀(Bio－Rad)、PE2400PCR儀(Perkin－Elmer)、Gel Doc 2000分子成像儀(Bio－Rad)和熒光顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 實驗設(shè)計與分組 實驗分組如下:(1)正常對照組:用DMEM培養(yǎng)液孵育細胞;(2)HTL處理組:分別用含有0.1、0.3、1 mmol/L HTL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細胞;(3)NAC+HTL組:在加入5 mmol/L NAC培養(yǎng)液孵育1 h后，再與HTL共同孵育內(nèi)皮細胞;(4)PDTC+HTL組:加入0.1 mmol/L PDTC培養(yǎng)液孵育1 h后，再與HTL共同孵育內(nèi)皮細胞;(5)Apocynin+HTL組:加入0.1 mmol/L Apo培養(yǎng)液孵育1 h后，再與HTL共同孵育內(nèi)皮細胞。

2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng) 取HUVECs解凍復蘇后加入含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，分別接種于100 mL細胞培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每隔2－3 d換液1次，待細胞80%融合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細胞至1×107/L、3×107/L、1 ×108/L，然后分別將細胞接種于96、24、6孔培養(yǎng)板中，待細胞80%融合時換成含1%小牛血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞達到同步化，然后分別加入不同的處理因素。

2.3 MTT比色法檢測細胞活力 將培養(yǎng)至第4代的單層內(nèi)皮細胞按常規(guī)消化后制成細胞懸液，以每孔103－104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為150 μL。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)15 μL 37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄除孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液。每孔中再加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使得結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度值。

2.4 細胞培養(yǎng)液中LDH活性測定 LDH能夠催化乳酸生成丙酮酸，后者與2，4－二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈現(xiàn)棕紅色，顏色深淺可間接反映LDH的活性，通過比色法測定其吸光度，計算酶的活力。具體嚴格操作按照試劑盒說明書進行，按下列公式計算:

LDH(U/L)=(測定管A值－測定空白管A值)÷(標準管A值－標準空白管A值)×標準管濃度(2 μmol/L)×1 000 mL×測試前樣品稀釋倍數(shù)。

2.5 NO的檢測 此法按試劑盒介紹操作，標準溶液用DMEM(+10%FBS)溶液進行稀釋和配制，濃度為(μmol/L):0、1、2、10、20、40、60 和 100，樣品為細胞培養(yǎng)液上清。每孔分別加上述溶液50 μL、Griess reagent I、Griess Reagent II溶液。即刻用酶標儀在540 nm波長處測定吸光度值。繪制標準曲線，然后根據(jù)標準曲線得出相應(yīng)的數(shù)值。

2.6 ROS的檢測[5]利用熒光探針 DCFH－DA進行ROS的檢測。DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。DCF的熒光可反映細胞內(nèi)活性氧的水平。

用無血清培養(yǎng)液按照1∶1 000比率稀釋DCFH－DA，使終濃度為10 μmol/L。去除細胞培養(yǎng)液，加入1 mL稀釋好的DCFH－DA。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH－DA。蓋玻片封片后熒光顯微鏡下觀察。使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，用熒光分光光度計檢測刺激前后熒光的強弱。

2.7 NF－κB活性的檢測[6]棄除培養(yǎng)液并用PBS液洗滌細胞1次。加固定液固定細胞15 min。棄除固定液，用PBS洗滌3次，每次3 min。用免疫染色封閉液室溫下封閉1 h，棄除免疫染色封閉液，加入NF－κB p65抗體，室溫下孵育1h并用PBS液洗滌3次，每次8 min。加入1 mL抗兔Cy3，室溫孵育1 h。洗滌液洗滌2次，每次5－10 min。加入1 mL細胞核染色液(DAPI)，吸除細胞核染色液，再用PBS液洗滌3次，每次5 min。滴加適量的抗熒光淬滅封片液，蓋玻片封片后熒光顯微鏡下觀察。NF－κB的染色為紅色熒光，細胞核的DAPI染色為藍色熒光。

2.8 免疫印跡法檢測IκBα 蛋白表達[7]細胞總蛋白提取:將1×108/L的細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中，置5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)，待細胞生長至80%，換含1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞處于靜止期。藥物處理后加入PBS沖洗3 次，加入 100 μL 細胞裂解液(20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1%Triton X － 100，1%sodium pyrophosphate，25 mmol/L β － glycerophosphate，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L Na3VO4，0.5 mg/L leupeptin，臨用時加入PMSF)置冰上裂解30 min，收集細胞。12 000 r/min、4℃離心30 min取上清液，按照BCA試劑盒說明書進行測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳:裝備膠槽，制備分離膠加入膠槽，上層加入少量水。待分離膠聚合完全后，用去離子水洗滌。隨后灌注積層膠，插入梳子，待堆積膠聚合后，拔去梳子，用去離子水沖洗加樣孔去除殘留的未聚合的膠。將玻板裝入電泳槽中，加入電泳緩沖液。將樣品加入上樣孔，其中一孔加入5－10 μL預染的蛋白質(zhì)分子量marker。常規(guī)垂直電泳，待電泳結(jié)束后，卸下玻璃板取下凝膠，對凝膠進行 Western blotting檢測。

Western blotting檢測:使用電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白質(zhì)從聚丙烯酞胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，轉(zhuǎn)膜完畢，將膜放入封閉液中，室溫下封閉1 h。將IκBαⅠ抗按1∶500稀釋加入封閉液中，50 r/min離心，4℃過夜。洗滌Ⅰ抗，用兔IgGⅡ抗1∶10 000稀釋后加入，室溫下1 h，洗滌Ⅱ抗。避光加入ECL溶液，反應(yīng)5 min，濾除多余的ECL液，在將膜放入顯影夾于暗室中顯影，曝光3 min，將膜顯影、定影。根據(jù)顯色條帶適當調(diào)整曝光時間和顯影時間使條帶更清晰。

2.9 TNF－α和sICAM－1濃度測定 采用雙抗體夾心ELISA法，檢測TNF－α和sICAM－1水平。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 HTL對內(nèi)皮細胞活力的影響

細胞與 HTL(1 mmol/L)孵育6 h、12 h和24 h后均能時間依賴性地降低內(nèi)皮細胞的活力，以24 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)孵育24 h后可以濃度依賴性地降低內(nèi)皮細胞活力，以1 mmol/L最明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育24 h作為實驗濃度與時間。如表1所示，1 mmol/L HTL與內(nèi)皮細胞共同孵育24 h可以顯著降低內(nèi)皮細胞活力(P＜0.01)，而PDTC、Apo與NAC均能夠不同程度地抑制HTL誘導的內(nèi)皮細胞活力的下降(P＜0.01)。

表1 各組處理因素對HTL誘導內(nèi)皮細胞活性、LDH、NO和ROS的影響Table 1.Influence of different group on cell viability，LDH，NO and ROS in ECs induced by HTL(±s.n=3)

表1 各組處理因素對HTL誘導內(nèi)皮細胞活性、LDH、NO和ROS的影響Table 1.Influence of different group on cell viability，LDH，NO and ROS in ECs induced by HTL(±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs HTL.

Group Cell viability LDH(U/L) NO(10－6mmol/L)ROS Control 0.89 ±0.09 84.3 ±7.2 24.7 ±3.1 0.11 ±0.01 HTL(1 mmol/L) 0.39 ±0.07＊＊ 172.7 ±12.4＊＊ 7.6 ±1.6＊＊ 0.37 ±0.02＊＊NAC(5 mmol/L)+HTL 0.80 ±0.10## 110.5 ±10.8## 18.5 ±2.1## 0.16 ±0.01##Apo(0.1 mmol/L)+HTL 0.75 ±0.08## 131.6 ±11.2## 16.1 ±2.0## 0.13 ±0.01##PDTC(0.1 mmol/L)+HTL 0.71 ±0.08## 125.3 ±13.1## 13.5 ±1.9## 0.23 ±0.02##

2 HTL對內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響

如表1所示，HTL(1 mmol/L)與內(nèi)皮細胞孵育24 h顯著增加培養(yǎng)液LDH活性，PDTC、Apo與NAC均能夠不同程度地抑制HTL誘導的LDH活性的增加(P＜0.01)。

3 HTL對內(nèi)皮細胞NO水平的影響

HTL(1 mmol/L)孵育6 h、12 h或24 h后均能顯著降低內(nèi)皮細胞中NO含量，以24 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用24 h后可以劑量依賴性地降低內(nèi)皮細胞中NO的含量，以1 mmol/L最為明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育24 h作為實驗的濃度與時間。如表1所示，1 mmol/L HTL與內(nèi)皮細胞共同孵育24 h可以降低內(nèi)皮細胞中NO的含量，PDTC、Apo與NAC能夠不同程度地升高內(nèi)皮細胞中的NO含量(P＜0.01)。

4 HTL對內(nèi)皮細胞中ROS水平的影響

HTL(1 mmol/L)作用1 h、3 h或6 h后均能顯著增加內(nèi)皮細胞中ROS含量(P＜0.01)，以3 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用3 h后可以劑量依賴性地增加內(nèi)皮細胞中ROS的含量，以1 mmol/L最為明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育3 h作為實驗濃度與時間。如表1及圖1所示，預先使用0.1 mmol/L Apo、5 mmol/L NAC和0.1 mmol/L PDTC均能夠顯著減少內(nèi)皮細胞中ROS的產(chǎn)生(P＜0.01)。

Figure 1.Influence of different treatments on ROS production in ECs(fluorescence microscope， × 200)A:positive control group;B:negative control group;C:HTL(1 mmol/L)group;D:PDTC(0.1 mmol/L)+HTL group;E:NAC(5 mmol/L)+HTL group;F:Apo(0.1 mmol/L)+HTL group.圖1 各組處理因素對內(nèi)皮細胞ROS水平的影響

5 HTL對內(nèi)皮細胞中NF－κB活性的影響

HTL(1 mmol/L)作用1 h、3 h或6 h后均能顯著增加內(nèi)皮細胞中NF－κB的激活，其中以3 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用3 h后可以劑量依賴性地增加內(nèi)皮細胞中NF－κB的活性。因此用HTL 1 mmol/L孵育3 h作為實驗濃度與時間。如圖2所示，預先使用0.1 mmol/L PDTC、0.1 mmol/L Apo和5 mmol/L NAC均可以顯著抑制內(nèi)皮細胞中NF－κB的激活。

Figure 2.Influence of different treatments on NF － κB in ECs(fluorescence microscope，×400).A:merged;B:DAPI staining for nuclei(blue);C:NF － κB p65(red).圖2 各組處理因素對內(nèi)皮細胞NF－κB活性的影響

6 HTL對內(nèi)皮細胞中IκBα蛋白表達的影響

圖3顯示的是HTL(1 mmol/L)作用0 h、0.5 h、1 h、3 h和6 h對IκBα蛋白表達的時效關(guān)系，從1 h以后HTL均能顯著降低內(nèi)皮細胞中IκBα蛋白的水平，其中以3 h最明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育3 h作為實驗濃度與時間。如圖4所示，與正常組相比，1 mmol/L HTL與內(nèi)皮細胞共同孵育3 h后，可以顯著降低內(nèi)皮細胞中IκBα蛋白的表達，預先使用0.1 mmol/L PDTC、0.1 mmol/L Apo和 5 mmol/L NAC均可以顯著增高內(nèi)皮細胞中IκBα蛋白的水平。

Figure 3.Effect of HTL(1 mmol/L)on IκBα protein expression in ECs at different time points.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 h.圖3 HTL對內(nèi)皮細胞IκBα蛋白表達的時效關(guān)系

7 HTL對內(nèi)皮細胞中sICAM－1和TNF－α濃度的影響

HTL(1 mmol/L)作用6 h、12 h和24 h均能顯著升高內(nèi)皮細胞上清液sICAM－1和TNF－α濃度，以24 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用 24 h 后可以劑量依賴性地升高內(nèi)皮細胞上清液中的sICAM－1、TNF－α濃度，以1 mmol/L最為明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育24 h作為實驗濃度與時間。如表2所示，預先使用 PDTC 0.1 mmol/L、Apo 0.1 mmol/L、5 mmol/L NAC可以顯著降低內(nèi)皮細胞中sICAM－1、TNF－α濃度(P＜0.01)。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，HTL顯著誘導了內(nèi)皮細胞功能受損，表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞活力下降，LDH漏出增加，抗氧化劑NAC、Apo以及NF－κB抑制劑PDTC與血管內(nèi)皮細胞預孵，顯著減輕了HTL誘導的內(nèi)皮細胞活力降低、LDH漏出。

Figure 4.Influence of different treatments on IκBα protein expression in ECs.1:control group(3 h);2:HTL(1 mmol/L，3 h)group;3:PDTC(0.1 mmol/L)+HTL(1 mmol/L，3 h)group;4:NAC(5 mmol/L)+HTL(1 mmol/L，3 h)group;5:Apo(0.1 mmol/L)+HTL(1 mmol/L，3 h)group.±s.n=3.*P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs HTL.圖4 不同時候HTL對IκB－α蛋白表達的影響

表2 內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清液中sICAM－1和TNF－α水平Table 2.Influence of different treatments on sICAM －1 and TNF－α content in culture supernatants of ECs(ng/L.±s.n=3)

表2 內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清液中sICAM－1和TNF－α水平Table 2.Influence of different treatments on sICAM －1 and TNF－α content in culture supernatants of ECs(ng/L.±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs HTL.

Group sICAM－1(ng/L) TNF－α(ng/L)Control 338.6 ±22.3 82.1 ±9.0 HTL(1 mmol/L) 1 025.8 ±33.7＊＊ 321.5 ±16.4＊＊NAC(5 mmol/L)+HTL 565.2 ±29.5## 180.2 ±15.1##Apo(0.1 mmol/L)+HTL 608.1 ±30.1## 168.3 ±12.3##PDTC(0.1 mmol/L)+HTL 532.2 ±25.2## 192.6 ±14.6##

氧化應(yīng)激即體內(nèi)ROS的蓄積。細胞內(nèi)活性氧的來源多種多樣，除線粒體呼吸鏈代謝產(chǎn)生以外，現(xiàn)有研究證實，內(nèi)皮細胞中的ROS主要來源于NADPH氧化酶途徑。NADPH氧化酶是細胞內(nèi)一種可誘導性電子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，利用NAD(P)H作為電子供體被單電子還原而催化氧分子生成超氧陰離子[6，7]。本實驗證實，HTL可以顯著增加ROS的產(chǎn)生，給予NADPH氧化酶抑制劑Apo以及NAC可以明顯降低細胞中ROS含量。

NF－κB是一種由p50以及p65兩種亞基組成的異源二聚體，未被激活時和IκBα形成一個復合物，分布在細胞漿中。在炎癥因子、生長因子或趨化因子等可以激活NF－κB的刺激存在的情況下，IκBα會在Ser32和Ser36被磷酸化，隨后被泛素－蛋白酶體途徑降解。NF－κB和IκBα解聚后，其核定位序列被暴露，從而被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)促進NF－κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄。NF－κB轉(zhuǎn)錄因子家族成員調(diào)控許多與炎癥相關(guān)的基因表達，如 TNF－α、IL－1、ICAM－1、VCAM－1等，而這些因子在動脈硬化發(fā)生發(fā)展過程中的各個環(huán)節(jié)均起重要作用[8，9]。大量實驗證據(jù)證明，氧化應(yīng)激誘導NF－κB的胞質(zhì)－核轉(zhuǎn)位，而抗氧化劑如NAC、PDTC能抑制IκB激酶的活性，阻止其被磷酸化和最終被降解，抑制NF－κB的轉(zhuǎn)位[10－11]。因此，氧化應(yīng)激激活 NF － κB 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)可能是通過信號轉(zhuǎn)導的級聯(lián)反應(yīng)而引起IκB磷酸化和最終被降解。本實驗所用NF－κB激活－核轉(zhuǎn)運檢測試劑盒僅染色p65，不染色RelB、C－Rel、p50和p52，使用后NF－κB呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。通過免疫染色檢測NF－κB的主要亞基p65是否被轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，就可以判斷NF－κB是否被激活。實驗發(fā)現(xiàn)，HTL增加了細胞中ROS的生成，降低了IκB的蛋白表達水平，1 mmol/L HTL可以明顯激活NF－κB;而預先給予Apo、NF－κB抑制劑PDTC和抗氧化劑NAC均可顯著提高IκBα的蛋白表達水平，從而抑制NF－κB的激活。

血管內(nèi)皮功能紊亂是動脈粥樣硬化最早的特征之一，而這種內(nèi)皮功能紊亂的一個重要原因是血管壁的慢性炎癥刺激。正常血管內(nèi)膜通常不發(fā)生白細胞黏附，但是在動脈硬化的早期階段，隨著內(nèi)皮細胞的損傷，在刺激因子的介導下，內(nèi)皮細胞開始表達包括TNF－α、ICAM－1等炎癥因子。研究發(fā)現(xiàn)，ICAM－1是介導細胞間或細胞與基質(zhì)間相互結(jié)合、相互作用的一類位于細胞膜表面的糖蛋白，主要參與炎癥細胞的黏附與聚集[12];TNF－α是觸發(fā)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的啟動子，可以誘導內(nèi)皮細胞、單核細胞產(chǎn)生IL－6、上調(diào)ICAM－1的表達，促進中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的黏附[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HTL可以刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的TNF－α、sICAM－1，而預先給予Apo以及PDTC、NAC可以顯著地降低內(nèi)皮細胞中TNF－α、sICAM－1的濃度。

綜上所述，本研究證實同型半胱氨酸硫內(nèi)酯引起血管內(nèi)皮細胞的損傷可以通過激活NADPH氧化酶導致氧化應(yīng)激，活化NF－κB并且使其進入細胞核內(nèi)造成炎癥因子sICAM－1、TNF－α的增多有關(guān)。

[1]譚紅梅，趙 馳，吳偉康，等.同型半胱氨酸對血管內(nèi)皮細胞增殖、貼壁和遷移的影響[J].中國病理生理雜志，2008，24(2):390－392.

[2]Kaplan ED.Association between homocyst(e)ine levels and risk of vascular events[J].Drugs Today，2003，39(3):175－192.

[3]Jakubowski H.Protein N －h(huán)omocysteinylation:implications for atherosclerosis[J].Biomed Pharmacother，2001，55(8):443－447.

[4]Desjardins F，Balligand JL.Nitric oxide－dependent endothelial function and cardiovascular disease[J].Acta Clin Belg，2006，61(6):326－334.

[5]Lü P，Luo HS，Zhou XP，et al.Reversal effect of thalidomide on established hepatic cirrhosis in rats via inhibition of nuclear factor－κB/inhibitor of nuclear factor－kappaB pathway[J].Arch Med Res，2007，38(1):15 －27.

[6]Griendling KK，Sorescu D，Ushio－Fulai M.NAD(P)H oxidase:role in cardiovascular biology and disease[J].Circ Res，2000，86(5):494 －501.

[7]Lassègue B，Clempus RE.Vascular NAD(P)H oxidases:specific features，expression and regulation[J].Am J Physiol Regul integr Comp Physiol，2003，285(2):R277 －R297.

[8]廖新學，孫勝楠，郭瑞鮮，等.JAK －STAT通路調(diào)制NF －κB介導H2O2預處理的細胞保護作用[J].中國病理生理雜志，2008，24(7):1422–1427.

[9]Ahn KS，Sethi G，Aggarwal BB.Simvastatin potentiates TNF－α－induced apoptosis through the down－regulation of NF－κB－dependent antiapoptotic gene products:role of IκBα kinase and TGF － β － activated kinase－1[J].J Immunol，2007，178(4):2507 －2516.

[10]Sury MD，F(xiàn)rese－Schaper M，Muhlemann MK，et al.Evidence that N－acetylcysteine inhibits TNF－α－induced cerebrovascular endothelin－1 upregulation via inhibition of mitogen－and stress－activated protein kinase[J].Free Radic Biol Med，2006，41(9):1372－1383.

[11]Nai YJ，Jiang ZW，Wang ZM，et al.Prevention of cancer cachexia by pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)in colon 26 tumor－ bearing mice[J].JPEN J Parenter Enteral Nutr，2007，31(1):18 －25.

[12]Witkowska AM，Borawka MH.Soluble intercellular adhension molecule－1(ICAM －1):an overview[J].Eur Cytokine Netw，2004，15(2):91 －98.

[13]Ogiwara F，Takahashi M，Ikeda V.Inflammatory markers and cytokines in cardiovascular disease[J].Rinsho Byori，2004，52(8):686－692.