孟錦繡， 李運(yùn)雄， 朱 平， 盧 聰， 鄭少憶， 余細(xì)勇△

(1廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心，2廣東省心血管病研究所，廣東廣州510080)

瓣膜病(valvular heart disease，VHD)是我國最常見的一種多發(fā)性心臟病，可由風(fēng)濕性、退行性和缺血性等多種病因引起，每年需要進(jìn)行瓣膜手術(shù)的患者達(dá)20多萬例，占成人心臟手術(shù)第1位[1]。各種病因所導(dǎo)致的瓣膜纖維化在各種年齡段上都有發(fā)生，危害最為嚴(yán)重。但是至今人們對導(dǎo)致瓣膜纖維化的分子機(jī)制還知之甚少，了解心臟瓣膜纖維化狀態(tài)下哪些分子參與了纖維化的形成是至關(guān)重要的工作。

心臟瓣膜纖維化是一個長期的慢性形成過程[2]，目前尚不能復(fù)制動物模型，對瓣膜纖維化的研究只能依賴于臨床樣本，而原始樣本的獲得是非常有限的，并且它們之間存在著明顯的個體差異，使實驗難以被重復(fù)和驗證。隨著國內(nèi)外對醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的重視，將原始臨床樣本用于研究的困難越來越大，在很大程度上制約了研究進(jìn)程。采用心臟心肌組織作為研究對象獲取間接實驗證據(jù)尚不能反應(yīng)瓣膜本身的病理機(jī)制，因此如果能獲得心臟瓣膜替換手術(shù)患者纖維化瓣膜的疾病相關(guān)分子信息，尤其是有效地獲得基因表達(dá)情況將能為瓣膜纖維化研究奠定重要的實驗基礎(chǔ)，但是國內(nèi)外尚未見該方面的報道。本研究探索性地利用人類纖維化心臟瓣膜，克服纖維化瓣膜含有細(xì)胞及其遺傳物質(zhì)少的困難，以SMART技術(shù)(switching mechanism at 5’end of the RNA transcript)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了高質(zhì)量的纖維化瓣膜的噬菌體表達(dá)文庫，為心臟瓣膜纖維化的分子機(jī)制研究奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

心臟瓣膜來自我院心外科手術(shù)的風(fēng)濕性心臟病患者纖維化心臟瓣膜組織，RNA提取試劑盒采用Qiagen公司的 RNeasy Plus Mini Kit，DNase I使用Qiagen公司的RNase－Free DNase Kit，使用Clontech公司的SMARTTMcDNA Library Construction Kit構(gòu)建纖維化瓣膜組織噬菌體表達(dá)文庫，λTriplEx2載體為Clontech產(chǎn)品，DNA聚合酶及其反應(yīng)體系為TaKaRa產(chǎn)品，樣本保存液購自TaKaRa。

2 方法

2.1 纖維化瓣膜組織總RNA的提取 手術(shù)取下的纖維化心臟瓣膜組織馬上置樣本保存液中，剪成約100－200 mg重的組織塊，在液氮中用手工研缽研成粉沫，然后加入350 μL的RLT緩沖液充分混勻。將裂解液全速離心3 min，取上清加入g－DNA離心柱中，12 000 r/min離心30 s，保留收集管中的液體。向收集管的液體中加入1體積70%乙醇，混合后加入RNeasy離心柱，12 000 r/min離心15 s，棄掉流過液，在離心柱中心加入700 μL buffer RW1，離心柱中心加入500 μL buffer RPE，12 000 r/min 離心15 s，丟棄流過液，在離心柱中心加入500 μL buffer RPE，12 000 r/min離心2 min，棄掉流過液。在離心柱中心加入30－50 μL無 RNase的水，12 000 r/min離心 1 min，洗脫收集RNA，用DNase I去除殘余的基因組DNA。用紫外分光光度計測RNA A260/A230及A260/A280，1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的抽提質(zhì)量及計算濃度。

2.2 纖維化瓣膜組織噬菌體展示文庫的構(gòu)建 文庫的構(gòu)建主要參照SMART cDNA Library Construction Kit操作程序并稍加改動。樣本分別提取的總RNA合在一起，采用 Promega公司的 PolyATract mRNA Isolation System分離PolyA+RNA。

①第1鏈的合成 300 ng RNA與1 μL SMART IVTM Oligonucleotide(12 μmol/L)和 1 μL CDS III/3’PCR primer(12 μmol/L)混勻，72 ℃水浴2 min后冰浴2 min。向10 μL反應(yīng)體系中分別加入2.0 μL 5× first－ strand buffer、1.0 μL DDT(10 mmol/L)、1.0 μL dNTP Mix(10 mmol/L)和 1.0 μL MMLV reverse transcriptase(2×108U/L)，42 ℃孵育1 h。

②用長距離PCR合成cDNA 在50 μL的反應(yīng)體系中加入 7 μL first－ strand cDNA、1 μL 5’PCR primer(5' － AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT － 3')、1 μL CDSⅢ/3’PCR primer[5'－ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG － d(T)30N－1N － 3']、5 μL 10 ×Advantage 2 PCR buffer、1 μL 50 × dNTP Mix、1 μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix 和 34 μL deionized H2O，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為95℃預(yù)變性20 s，95℃15 s，68 ℃ 8 min，共18 個循環(huán)。

③蛋白酶K消化和純化 為了滅活DNA聚合酶的活性，在3 μg的雙鏈cDNA和2 μL蛋白酶K(20 g/L)在45℃共同孵育20 min。消化產(chǎn)物按操作程序進(jìn)行純化，并用79 μL去離子水重懸沉淀。

④Sfi I酶切 為連接入λTriplEx2載體對雙鏈cDNA進(jìn)行Sfi I黏性末端酶切，100 μL反應(yīng)體系中包括10 μL 10 × Sfi buffer、10 μL Sfi I和 1 μL 100 × BSA，50℃ 酶切2 h。

⑤cDNA片段的過柱分級收集 產(chǎn)物用CHROMA SPIN－400過柱分級收集cDNA，共收集15份，每份取3 μL行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外下確定高峰度收集管，含有cDNA的前6個收集管合在一起，加入醋酸、糖原和－20℃預(yù)冷的95%乙醇置－20℃過夜后離心，小心棄去上清，用70%乙醇洗沉淀并真空干燥，加入7 μL去離子水溶解沉淀并保存在－20℃。

⑥cDNA連入 λTriplEx2載體 cDNA和 λTriplEx2載體以1∶10的比列進(jìn)行連接，反應(yīng)體系包括cDNA、λTriplEx2載體、連接反應(yīng)緩沖液、T4 DNA連接酶、ATP和去離子水，16℃孵育過夜。

⑦λ噬菌體的包裝 連接產(chǎn)物和25 μL包裝蛋白在30℃孵育90 min后再加入25 μL包裝蛋白，30℃孵育90 min，然后加入 500 μL噬菌體緩沖液，加入25 μL氯仿即得原始文庫。

2.3 原始文庫的鑒定 用LB/tetracycline培養(yǎng)基準(zhǔn)備XL1－Blue工作平板，挑取大腸桿菌XL1－Blue單克隆菌落，接種到15 mL LB/MgSO4/maltose培養(yǎng)液37℃ 增菌培養(yǎng)過夜，至A600=2.0時離心收集細(xì)菌，加入7.5 mL 10 mmo/L MgSO4重懸細(xì)菌。從原始庫吸出2 μL，用1×λ稀釋緩沖液按不同比例稀釋，各取 1 μL加入到 200 μL過夜培養(yǎng)的 XL1－Blue，37℃水浴15 min，加入3 mL已溶解預(yù)熱至48℃的LB/MgSO4頂層瓊脂混勻，鋪在準(zhǔn)備好的90 mm LB/MgSO4平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。統(tǒng)計噬菌斑，計算出噬菌體滴度(103pfu/L)。

2.4 非擴(kuò)增文庫重組克隆比列的鑒定 從原始庫吸出2 μL，加入3 mL已溶解預(yù)熱至48℃的LB/Mg-SO4頂層瓊脂混勻，頂瓊脂中預(yù)先加入50 μL IPTG和50 μL X －gal(0.1 mol/L)，鋪到直徑90 mm LB/Mg-SO4平板上，計算白斑所占百分比。

2.5 cDNA重組插入片段的鑒定 根據(jù)克隆位點(diǎn)兩端序列設(shè)計合成引物 1(5’－CTCCGAGATGGACGAGC－3’)和引物2(5’－TAATACGACTCACTATAGGG－3’)，挑取噬菌斑單克隆放入15 μL去離子水中，100℃ 加熱10 min制備成DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μL反應(yīng)體系中包括2×MightyAmp buffer 25 μL，引物 1 1.5 μL，引物2 1.5 μL，DNA 模板 5 μL，DNA 聚合酶1 μL，去離子水 27 μL，PCR 條件為95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s，72 ℃1 min，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

結(jié) 果

1 RNA分析

各樣本提取總RNA的A260/A280比值是2.0－2.1之間，260 nm處的紫外吸收度測定平均濃度為180 mg/L。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA可見2條明亮的條帶，見圖1，28S rRNA比18S rRNA明亮提示RNA分離過程中無降解或污染，5S rRNA在純化回收柱中屬濾過物質(zhì)，所以該電泳圖上看不到5S rRNA條帶。因此證明從樣本中分離的總RNA是純凈、完整和穩(wěn)定的，可用于cDNA文庫的構(gòu)建。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示了polyA+RNA涂布位于0.4－4.0 kb之間。因此說明獲得了高質(zhì)高量的總RNA。cDNA的質(zhì)量對于構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫非常關(guān)鍵，cDNA的質(zhì)量受mRNA的影響?？俁NA和mRNA的質(zhì)量和完整性經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果是滿足文庫構(gòu)建要求的。

Figure 1.Identification of isolated RNA from fibrotic valves.M:DNA molecular marker;Lane 1:RNA isolated from fibrotic valves.圖1 纖維化心臟瓣膜提取RNA的電泳鑒定

2 引物延伸產(chǎn)物的分析

用polyA+RNA合成第1鏈cDNA，然后全部體積的單鏈cDNA用來合成雙鏈，從產(chǎn)物中取5 μL用瓊脂糖凝膠電泳分析，雙鏈cDNA的條帶呈分散狀，長度主要分布在0.2－3.0 kb。

3 cDNA片段的分級分析

為避免文庫中含有太多較小插入和非插入性克隆，用CHROMA SPIN－400柱分級回收cDNA以去除小于500 bp和大于3 000 bp的cDNA片段，15個收集管中分別取樣經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，有5個收集管中的cDNA片段符合要求，cDNA片段經(jīng)富集、沉淀和去離子水重懸用于連接。

4 cDNA文庫的分析

4.1 原始文庫的滴度測定和重組率的鑒定 根據(jù)cDNA和λ噬菌體載體(1/10)的濃度比值測定非擴(kuò)增文庫即原始文庫的滴度為8×109pfu/L。用X－gal分析重組克隆，平板上1 000個噬菌斑中有10個藍(lán)斑，計算重組率為99%。

4.2 cDNA重組插入片段的鑒定 隨機(jī)挑選16個噬菌斑用通用引物做PCR擴(kuò)增。其中81.25%的外源基因(13/16)的PCR產(chǎn)物大于1.0 kb，18.75%的外源基因(3/16)小于1.0 kb，但全部插入片段大于0.5 kb，見圖2。

Figure 2.Identification of cDNA inserted segments of fibrotic heart valve library.M:DNA molecular marker;Lane 1－16:cDNA inserted segments identified by PCR.圖2 PCR鑒定纖維化心瓣膜噬菌體表達(dá)文庫的外源基因插入片段

討 論

瓣膜病是我國最常見的一種多發(fā)性心臟病，多表現(xiàn)為瓣膜的纖維化和鈣化，可由風(fēng)濕性、退行性和缺血性等多種病因引起，而瓣膜纖維化和鈣化是最嚴(yán)重的結(jié)局，它在各年齡段上都有發(fā)生[3]，是危害最嚴(yán)重的瓣膜病之一[1，2]。

瓣膜纖維化以風(fēng)濕性和老年性最為常見[1]。包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家，尤其是地處亞熱帶地區(qū)的國家，風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病仍然是常見病、多發(fā)病[4，5]。其中風(fēng)濕性心臟瓣膜病最為常見，一般認(rèn)為是風(fēng)濕熱反復(fù)發(fā)作而導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)損害心臟造成的[6－8]。新近的研究表明，柯薩奇 B 組(B3、B4)病毒感染也可導(dǎo)致與風(fēng)濕性心臟病相同的免疫損害，最終也表現(xiàn)為心臟瓣膜的纖維化和鈣化[9，10]。在西方發(fā)達(dá)國家瓣膜性疾病主要是以老年性為主，隨著我國人口老齡化，老年性疾病日益受到重視，其中，由退行性變所致的老年心臟瓣膜病逐漸增多，最終都表現(xiàn)為瓣膜的纖維化和鈣化[11]。據(jù)統(tǒng)計，我國老年性退行性心臟瓣膜病的患病率為20%－25%，而且隨著年齡的增加患病率也有所增高，在75歲以上人群中，瓣膜纖維化和鈣化的患病率為37%[12，13]。

基因表達(dá)對生理和病理生理機(jī)制具有重要的作用，因此了解某一狀態(tài)下基因的表達(dá)情況對理解正常和病理狀態(tài)非常關(guān)鍵，也為發(fā)現(xiàn)新的疾病相關(guān)基因提供了新策略。但目前人們對心臟瓣膜的纖維化機(jī)制了解尚少，在研究中由于瓣膜樣本難以獲得，獲得的樣本基本處于纖維化的晚期，其細(xì)胞成份被大量的纖維組織所取代，因此材料來源受限成為造成心臟瓣膜纖維化分子機(jī)制研究的瓶頸之一。構(gòu)建cDNA噬菌體表達(dá)文庫是記錄、保存、篩選功能基因和進(jìn)行差異性功能表達(dá)的重要手段，cDNA文庫也為獲得感興趣的基因發(fā)揮了非常重要的作用。

在本研究中，我們成功構(gòu)建了高質(zhì)量的纖維化心臟瓣膜組織噬菌體表達(dá)文庫，經(jīng)鑒定原始文庫的滴度是8×109pfu/L，根據(jù)藍(lán)白斑篩選重組的比列是99%，完全能夠代表mRNA復(fù)雜性，一般來說1×106就能夠代表mRNA復(fù)雜性了[14]。外源基因片段中81.25%的大于1 kb，18.75%在0.5－1.0 kb之間，大多數(shù)插入片段大于0.5 kb。通過該文庫的構(gòu)建，我們把有限的珍貴樣本資源以一種可以有效重復(fù)使用的庫的形式保留下來，方便于為之后的研究源源不斷地提供材料，cDNA文庫的構(gòu)建為尋找相關(guān)基因和研究它們的功能奠定了基礎(chǔ)，最重要的是噬菌體原始文庫的構(gòu)建使后繼研究不受原始材料的限制。

評價一個cDNA文庫的質(zhì)量 ，主要是看該 cDNA文庫的庫容量和重組噬菌體中插入的cDNA片段長度。高質(zhì)量cDNA文庫的克隆數(shù) (獨(dú)立克隆數(shù))一般要求大于1×106，并且重組率要求高于80%，而本實驗所構(gòu)建的cDNA文庫未擴(kuò)增時滴度8×109pfu/L，經(jīng)藍(lán)白斑鑒定重組率為99%，外源插入片段大小介于500－2 000 bp之間，其中81.25%大于1 kb，完全符合高質(zhì)量文庫要求。另外，cDNA的質(zhì)量對于構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫非常關(guān)鍵，而cDNA的質(zhì)量受mRNA的影響。本研究中，總RNA的A260/A280比值是2.0－2.1，從樣本中分離的總 RNA是純凈、完整和穩(wěn)定的，可用于cDNA文庫的構(gòu)建。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示了polyA+RNA涂布位于0.4－4.0 kb之間，因此說明獲得了高質(zhì)高量的總RNA，為構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫提供了保障。

本研究采用SMART專利技術(shù)所構(gòu)建的文庫具有明顯的特點(diǎn)，如可以直接表達(dá)外源基因、便于蛋白和核酸等多種技術(shù)篩選目的基因、易獲得稀有基因和全長基因等。

用SMART primer extension－PCR技術(shù)構(gòu)建的cDNA噬菌體表達(dá)文庫，易篩選出疾病全長基因cDNA克隆，為疾病功能基因組研究提供了有用資源。與含內(nèi)含子的基因組cDNA不同的是，cDNA具有一個能夠表達(dá)的開放閱讀框，基因可以直接用于體外表達(dá)，根據(jù)目的基因的特點(diǎn)可以用相應(yīng)配體或抗體進(jìn)行方便的功能性篩選，可同時獲得功能蛋白及其編碼基因，因此cDNA噬菌體表達(dá)文庫不僅可以用來篩選目的基因，也可以用于表達(dá)這些基因。

Maniatis的早期工作為cDNA文庫用于分子和基因組研究奠定了基礎(chǔ)，從此cDNA文庫的構(gòu)建成為基因組學(xué)研究最基本和最重要的工具之一。噬菌體表達(dá)cDNA文庫的構(gòu)建可以用來尋找疾病相關(guān)基因和感興趣蛋白。例如，從病人提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄來的單鏈cDNA可以與正常對照的cDNA文庫進(jìn)行雜交，剩下的cDNA可以作為削減cDNA探針來篩選疾病樣本的cDNA文庫來獲得同源性克隆。也可以用特定疾病相關(guān)抗體或相互作用的分子配體作為免疫探針，對表達(dá)文庫進(jìn)行免疫篩選，從而獲得具有生理或疾病相關(guān)功能的蛋白及其編碼基因片段甚至全長。

另一方面，cDNA文庫除能被用于鑒定感興趣的基因，也可以為全長基因的克隆提供材料。對cDNAs的研究仍然是詮釋基因結(jié)構(gòu)和功能的一種重要手段，獲得全長和完整的cDNA文庫在程序上仍然具有挑戰(zhàn)性。本研究采用了Clontech公司的SMART專利技術(shù)，在原理上只有含全長mRNA及SMART寡核苷酸的模板才能在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增出來，因此，用此技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫與其它文庫構(gòu)建方法相比，可以消除基因組DNA或polyA－RNA對文庫的污染，能以少量(少至50 ng)總RNA選擇性地擴(kuò)增出全長cDNA，建立高質(zhì)量、高重組率的全長cDNA文庫。

因此，雖然與疾病相關(guān)的cDNA在公共數(shù)據(jù)庫里是有限的，而cDNA文庫的構(gòu)建和基因克隆方法的改進(jìn)將有助于研究特定條件下表達(dá)基因的克隆和鑒定，也將有利于進(jìn)一步闡明疾病和病原相互作用的分子機(jī)制。

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