徐武杰,潘魯青＊＊,岳 峰,李 健

(1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003;2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071)

氨氮脅迫對三疣梭子蟹消化酶活力的影響

徐武杰1,潘魯青1＊＊,岳 峰1,李 健2

(1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003;2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071)

以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)為研究對象,研究氨氮脅迫對中腸腺、胃、腸組織消化酶活力的影響。實驗設(shè)計對照組(自然海水)、1、5、20 mg/L處理組,分別于氨氮脅迫后0、6、12、24、48 h取樣進行消化酶活力的測定。結(jié)果表明:氨氮脅迫對三疣梭子蟹類胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力影響顯著(P<0.05),而對照組無明顯變化。各處理組3種消化器官中類胰蛋白酶、胃蛋白酶活力在48 h內(nèi)呈峰值變化,其中3種消化器官中類胰蛋白酶活力在48 h時恢復至對照組水平,而中腸腺胃蛋白酶活力在24 h后趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯正相關(guān),胃和腸的胃蛋白酶活力分別于48和24 h時恢復至對照組水平。各處理組中腸腺和胃的脂肪酶活力在24 h內(nèi)均呈現(xiàn)明顯的峰值變化,24 h后中腸腺中脂肪酶活力趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯正相關(guān),而胃中脂肪酶活力逐漸下降,至48 h時恢復至對照組水平。各處理組中腸腺和腸的淀粉酶活力在12 h內(nèi)呈逐漸下降趨勢,12 h后趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯負相關(guān);各處理組胃的淀粉酶活力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,24 h后趨于穩(wěn)定。同時在氨氮脅迫48 h時,對中腸腺和胃的胃蛋白酶、脂肪酶活力均表現(xiàn)為明顯的誘導作用,而對3種消化器官中淀粉酶活力表現(xiàn)為明顯的抑制作用。由此說明,三疣梭子蟹在氨氮脅迫下中腸腺中胃蛋白酶、脂肪酶活力和3種消化器官中淀粉酶活力可作為消化吸收能力的評價指標。

氨氮脅迫;三疣梭子蟹;消化酶活力

氨氮是養(yǎng)殖水環(huán)境中重要的污染脅迫因子,它不僅能直接損害甲殼動物的器官組織[1-2],并能滲入血淋巴中產(chǎn)生毒害作用[3],嚴重影響甲殼動物的生理代謝功能[4-8]。三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)屬大型底棲蟹類,是我國沿海重要的養(yǎng)殖種類,在養(yǎng)殖過程中主要以投喂新鮮的小雜魚蝦為主,易污染水質(zhì),近年來由于養(yǎng)殖密度加大、投食過多,積累的殘餌、代謝廢物等有機物在微生物的氨化作用下不斷形成氨氮,導致氨氮濃度逐漸增大,已成為三疣梭子蟹生長、存活的重要脅迫因子。甲殼動物中腸腺是主要的消化和解毒代謝器官,已有研究表明甲殼動物在氨氮脅迫下中腸腺通過分泌大量的解毒代謝酶類來降低氨氮的毒害作用[8-10],同時氨氮脅迫也引起中腸腺細胞組成、數(shù)量發(fā)生變化,對細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷效應(yīng),嚴重影響了消化酶分泌等生理功能[1,11]。動物消化酶活力的高低直接反映了其對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收利用的能力,從而決定動物的生長發(fā)育的速度,目前有關(guān)氨氮對甲殼動物消化酶活力的影響尚未見報道。本文研究了氨氮脅迫對三疣梭子蟹消化器官中類胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影響,探討了氨氮脅迫對三疣梭子蟹消化生理的影響機制,旨在篩選三疣梭子蟹在氨氮脅迫下消化吸收能力的評價指標,為三疣梭子蟹健康養(yǎng)殖的水環(huán)境管理技術(shù)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用三疣梭子蟹購自青島市沙子口碼頭,全甲寬為(12.2±0.58)cm,甲長為(5.7±0.19)cm,體質(zhì)量為(104.8±9.6)g,體色正常,健康活潑。實驗前暫養(yǎng)10 d,海水鹽度為31,p H=8.2,溫度為(15± 0.5)℃,氨氮為(0.08±0.02)mg·L-1,連續(xù)充氣,日換水2次,換水量為1/2～2/3,并按體質(zhì)量的10%投喂新鮮的菲律賓蛤仔。

1.2 實驗梯度設(shè)置

根據(jù)Chen和鐘碩良等[12-13]測定海水養(yǎng)殖池塘底層水的氨氮濃度分別為0～46 mg·L-1和0.01～29.3 mg·L-1,實驗設(shè)置4個氨氮梯度,分別為0(對照組,自然海水)、1、5、20 mg·L-1,各梯度采用10 g·L-1的氯化銨溶液進行調(diào)節(jié)。實驗在136 cm×90 cm×70 cm的塑料水槽內(nèi)進行,將暫養(yǎng)在自然海水中健康的三疣梭子蟹饑餓48 h后,隨機移入各實驗梯度中,每個水槽分別放三疣梭子蟹15只,每個梯度均設(shè)3個平行組,實驗期間不投喂餌料,并且養(yǎng)殖管理與暫養(yǎng)期間完全相同,換水時分別加入相應(yīng)氨氮濃度的養(yǎng)殖用水。在實驗過程中每隔6 h采用次溴酸鹽氧化法[14]測定1次氨氮濃度,實測值分別為(0.08±0.01)、(1.20± 0.08)、(5.37±0.10)、(21.26±0.35)mg·L-1。實驗期間三疣梭子蟹無死亡現(xiàn)象,取樣時間為0、6、12、24和48 h。

1.3 樣品的采集與制備

每個水槽隨機取3只蟹,置冰盤內(nèi)解剖,取出完整的中腸腺、胃和腸,分別剪開胃和腸,用預冷超純水(0～4℃,p H=6.8)將內(nèi)容物沖洗掉,用濾紙輕輕吸干水分,分別保存于-80℃冰箱中。

分別取濕質(zhì)量為100 mg左右的中腸腺、胃、腸樣品,加入10倍體積(質(zhì)量濃度)預冷超純水,置于冰浴中用勻漿機以轉(zhuǎn)速10 000 r/min勻漿5 min,取部分勻漿液直接用于測定脂肪酶活力,其余勻漿液用高速冷凍離心機(0～1℃)以10 000 r/min離心30 min,取上清液用于類胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶活力的測定。

1.4 酶活力的測定

類胰蛋白酶和胃蛋白酶活力測定:參照文獻[15]的方法。加入以0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(p H= 8.4)配置的0.5%酪蛋白2.0 mL,0.04 mol·L-1EDTA-Na20.1 mL,酶液0.4 mL,并加入超純水0.5 mL,使總體積為3.0 mL,混勻,置于55℃水浴中反應(yīng)15 min,然后加入30%三氯醋酸1.0 mL終止反應(yīng);離心(0～1℃,3 000 r/min)15 min,取上清液1 mL,加入0.55 mol·L-1碳酸鈉溶液2.5 mL,再加入福林試劑0.5 mL,37℃水浴中顯色15 min,在680 nm波長下測定光密度(O.D.)值,得生成酪氨酸質(zhì)量。類胰蛋白酶活力定義為:在55℃下,每分鐘水解酪蛋白所產(chǎn)生的1μg酪氨酸作為1個酶活力單位U(μg/min)。

胃蛋白酶活力測定基本上同類胰蛋白酶,所用緩沖液改為0.2 mol·L-1檸檬酸緩沖液(p H=3.0)。

脂肪酶活力測定:參考文獻[16]的方法并作適當改進。取1.5 mL 0.066 7 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(p H=7.38)和0.5 mL橄欖油,放入37℃水浴恒溫磁力攪拌器中預熱5 min,加入0.5 mL酶液,磁力攪拌10 min,立即加入4 mL甲苯,繼續(xù)攪拌2 min,終止反應(yīng);然后在4 000 r/min下離心10 min,取上層有機相2 mL于小錐形瓶中,加入5%(質(zhì)量濃度)醋酸銅溶液0.5 mL,磁力攪拌3 min,4 000 r/min下離心10 min,取上層含有綠色脂肪酸銅的甲苯溶液,在710 nm波長下測定光密度(O.D.)值,并計算脂肪酸濃度。脂肪酶活力單位定義為:在37℃下,每分鐘催化橄欖油釋放出1μmol脂肪酸作為1個酶活力單位U(μmol/min)。按下式計算酶活力:

X=(c·V)/(t·V′)

式中:X為脂肪酶活力(U),c為脂肪酸濃度(μmol·mL-1),V為脂肪酸萃取液的體積(mL),V′為酶液的用量(mL);t為作用時間(min)。

淀粉酶活力測定:參照文獻[15]的方法。加入用0.066 7 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(p H=7.5)配制的1%淀粉溶液0.5 mL,置于65℃恒溫水浴中,加入超純水0.3 mL,酶液0.2 mL,搖勻,保溫3 min后立即加入3,5-二硝基水楊酸指示劑溶液2.0 mL,搖勻后置于沸水浴5 min,取出進行流水冷卻,用超純水定容至10 mL,在540 nm波長下測定光密度(O.D.)值,計算生成麥芽糖質(zhì)量。淀粉酶活力單位定義為:在65℃下,每分鐘催化淀粉生成1 mg麥芽糖作為1個酶活力單位U(mg/min)。

酶液蛋白濃度測定:以牛血清蛋白為標準物,采用考馬斯亮藍法測定[17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(mean±S. E.)表示,并用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗法統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 氨氮脅迫對三疣梭子蟹類胰蛋白酶和胃蛋白酶活力的影響

由圖1、2可看出,氨氮脅迫對三疣梭子蟹類胰蛋白酶和胃蛋白酶活力影響顯著(P<0.05),而對照組無明顯變化。各處理組中腸腺的類胰蛋白酶、胃蛋白酶活力在48 h內(nèi)呈峰值變化,分別于24和12 h時達到最小值和最大值,其中類胰蛋白酶活力在48 h時恢復至對照組水平,而胃蛋白酶活力在24 h后趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯正相關(guān);各處理組胃和腸的類胰蛋白酶、胃蛋白酶活力在48 h內(nèi)也呈明顯的峰值變化,均于12 h時達到最大值,2種消化器官中類胰蛋白酶活力于48 h時恢復至對照組水平,而胃蛋白酶活力分別于48、24 h時恢復至對照組水平。

2.2 氨氮脅迫對三疣梭子蟹脂肪酶活力的影響

圖3表明,氨氮脅迫對三疣梭子蟹中腸腺和胃的脂肪酶活力的影響顯著(P<0.05),而對照組無明顯變化;腸中脂肪酶活力很低,實驗未檢出。各處理組2種消化器官中脂肪酶活力在24 h內(nèi)均呈現(xiàn)明顯的峰值變化,均于12 h達到最大值,24 h后中腸腺的脂肪酶活力趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯正相關(guān);而胃的脂肪酶活力逐漸下降,至48 h時恢復至對照組水平。

圖1 氨氮脅迫對三疣梭子蟹類胰蛋白酶活力的影響Fig.1 Time course changes of Trypsin-like enzyme activities of swimming crabPortunus trituberculatus exposed to ambient ammonia

圖3 氨氮脅迫對三疣梭子蟹脂肪酶活力的影響Fig.3 Time course changes of lipase activities of swimming crabPortunus trituberculatusexposed to ambient ammonia

2.3 氨氮脅迫對三疣梭子蟹淀粉酶活力的影響

由圖4可知,氨氮脅迫對三疣梭子蟹淀粉酶活力影響顯著(P<0.05),而對照組無顯著變化。各處理組中腸腺和腸的淀粉酶活力在12 h內(nèi)呈逐漸下降趨勢,在12 h時降至最低值,12 h后趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯負相關(guān);各處理組胃的淀粉酶活力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,于12 h達到最大值,在24～48 h內(nèi)酶活力被抑制,且趨于穩(wěn)定,1、5與20 mg·L-1處理組差異顯著。

圖2 氨氮脅迫對三疣梭子蟹胃蛋白酶活力的影響Fig.2 Time course changes of pepsin activities of swimming crabPortunus trituberculatusexposed to ambient ammonia

圖4 氨氮脅迫對三疣梭子蟹淀粉酶活力的影響Fig.4 Time course changes of amylase activities of swimming crabPortunus trituberculatusexposed to ambient ammonia

2.4 三疣梭子蟹在氨氮脅迫下消化酶的活性分布

由表1可見,三疣梭子蟹不同消化器官中消化酶活力不同,3種消化器官中類胰蛋白酶、胃蛋白酶和淀粉酶活力大小均為:中腸腺>腸>胃,而中腸腺、胃的脂肪酶活力大小相近;在氨氮脅迫48 h時,對中腸腺和胃的胃蛋白酶、脂肪酶活力影響顯著,均表現(xiàn)為明顯的誘導作用,而對3種消化器官中淀粉酶活力均表現(xiàn)為明顯的抑制作用。

表1 在氨氮脅迫48 h時三疣梭子蟹消化器官中消化酶的活性分布Table 1 Distribution of the digestive enzymes of different digestive organs ofPortunus trituberculatus exposed to ambient ammonia for 48 h(mean±S.E)

3 討論

3.1 氨氮脅迫對三疣梭子蟹消化酶活力的影響

據(jù)王維娜等[18]報道在不同p H(7.6～9.8)水環(huán)境中飼養(yǎng)14 d時,日本沼蝦(Macrobrochium nipponense)中腸腺類胰蛋白酶和胃蛋白酶活力隨著p H值升高而升高,均于p H為9.8時達到最大值;楊志彪等[19]研究發(fā)現(xiàn)在Cu2+(0.01～5.00 mg·L-1)作用10 d后,中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)中腸腺類胰蛋白酶、胃蛋白酶和淀粉酶活力隨Cu2+濃度升高均有不同程度降低,而脂肪酶活力隨著Cu2+濃度升高而顯著升高。據(jù)Antoine[20]報道歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)在氨氮(0.53～16.11 mg·L-1)慢性脅迫下飼料轉(zhuǎn)化率隨著氨氮濃度升高而升高。本研究表明三疣梭子蟹在氨氮脅迫下3種消化器官中消化酶活力均呈現(xiàn)明顯的峰值變化,至24和48 h時趨于穩(wěn)定或恢復至對照組水平,穩(wěn)定后各處理組中腸腺胃蛋白酶、脂肪酶活力和3種消化器官淀粉酶活力分別與氨氮濃度呈明顯正、負相關(guān)性,表現(xiàn)出明顯的時間、劑量效應(yīng)關(guān)系,這與上述環(huán)境脅迫對甲殼動物消化酶活力影響的研究結(jié)果基本類似。同時本實驗中1 mg·L-1氨氮處理組(相當于非離子氨濃度0.033 mg·L-1)接近《國家標準漁業(yè)水質(zhì)標準》(GB11607-89)非離子氨濃度允許范圍上限0.020 mg·L-1,對消化酶活力也產(chǎn)生顯著性影響,這說明消化酶活力可以靈敏地反映出三疣梭子蟹在氨氮脅迫下消化吸收能力的變化。因此,作者認為三疣梭子蟹在氨氮脅迫下中腸腺中胃蛋白酶、脂肪酶活力和3種消化器官中淀粉酶活力可作為消化吸收能力的評價指標。

3.2 氨氮脅迫對三疣梭子蟹消化生理的影響機制

甲殼動物因環(huán)境脅迫或刺激產(chǎn)生一系列的生理防御反應(yīng),當超出機體自身特定的生理代謝機能時,可啟動機體的代謝補償功能以適應(yīng)外界環(huán)境的變化,最終產(chǎn)生應(yīng)激適應(yīng)。本研究顯示在氨氮脅迫范圍內(nèi),除中腸腺類胰蛋白酶活力表現(xiàn)為明顯的抑制作用外,三疣梭子蟹3種消化器官中類胰蛋白酶、胃蛋白酶和脂肪酶活力在12 h時均達到最大值,表現(xiàn)出明顯的誘導作用,而且胃、腸中蛋白酶的誘導作用隨脅迫濃度增大而降低,而脂肪酶呈現(xiàn)相反的趨勢。已有研究表明甲殼動物受到氨氮脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),耗氧量增多,能量需求增加,生理代謝發(fā)生相應(yīng)的變化[4-8];Stebbing[21]認為在毒物作用下生物酶出現(xiàn)的這種增益現(xiàn)象,是在無毒情況下的1種刺激反應(yīng),并把這一現(xiàn)象稱為“毒物興奮效應(yīng)”。這說明三疣梭子蟹因氨氮脅迫短時間內(nèi)消化酶活力升高,提高了機體的消化吸收利用能力,可能是用于補償因環(huán)境應(yīng)激所需的能量消耗,滿足機體應(yīng)激代謝的能量需求,同時這種“毒物興奮效應(yīng)”在胃、腸中對不同消化酶的誘導表現(xiàn)不同,這主要是因為“毒物興奮效應(yīng)”不僅與氨氮脅迫濃度有關(guān),而且不同消化酶對氨氮脅迫的生理適應(yīng)程度也有差異,由此在生理代謝補償適應(yīng)機制方面有待進一步研究。

據(jù)Kleber等[22]報道圣保羅對蝦(Farf antepenaeus paulensis)幼蝦在低濃度氨氮(0.016～0.287 mg·L-1)長期暴露下,能量代謝同樣發(fā)生顯著改變,表現(xiàn)為機體脂質(zhì)含量顯著減少,碳水化合物含量顯著增多;Hong等[8]研究表明暴露于氨氮(20～80 mg·L-1)48 h時,中華絨螯蟹幼蟹會通過減少碳水化合物的代謝,同時增加脂質(zhì)利用來滿足機體代謝需求,這與Racotta等[7]將凡納濱對蝦(L itopenaeus vannamei)幼蝦置于氨氮(0.36～2.14 mmol/L)暴露24 h時的代謝反應(yīng)是一致的;Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)在氨氮(0.994～20.728 mg· L-1)脅迫24 h時,斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)血淋巴中總蛋白濃度也會顯著下降。本實驗表明在氨氮脅迫48 h時,三疣梭子蟹中腸腺胃蛋白酶、脂肪酶活力表現(xiàn)為明顯的誘導作用,而3種消化器官淀粉酶活力呈現(xiàn)顯著的抑制作用,這與上述研究結(jié)果是相符的。另有Chen等[10]研究顯示隨著氨氮脅迫時間的延長(24 h后),斑節(jié)對蝦可能會通過中腸腺等組織的解毒代謝來降低氨氮的毒害作用;張克儉[1]研究發(fā)現(xiàn)在不同濃度氨氮(2.44～11.44 mg·L-1)作用7.5 d時,中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)肝胰臟最明顯的變化就是肝管的吸收細胞部分或全部轉(zhuǎn)變成分泌細胞,致使肝管壁中的分泌細胞增多,分泌細胞內(nèi)出現(xiàn)很多的分泌小泡,而分泌小泡內(nèi)含有多種酶類,具有分解消化有機大分子物質(zhì)和部分解毒代謝作用。由此說明甲殼動物在氨氮脅迫下可以通過調(diào)節(jié)消化酶和解毒代謝酶的合成與分泌,提高對蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的消化吸收能力,降低對糖類的消化利用,從而滿足機體的能量代謝和解毒代謝的需求。作者認為氨氮脅迫對甲殼動物中腸腺、胃和腸3種消化酶活力產(chǎn)生不同的影響,不僅與甲殼動物對氨氮的解毒代謝有關(guān),也與消化酶的酸堿特性相關(guān),如許多學者研究表明隨著水環(huán)境中氨氮濃度升高,甲殼動物血淋巴及中腸腺中氨氮濃度增加,氨氮排泄減少,從而導致血淋巴或中腸腺等組織中p H出現(xiàn)變化[9-10,24-25],由此引起消化酶活力出現(xiàn)相應(yīng)變化,其影響機制尚需進一步研究。

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Abstract: To study the effects of ammonia-N stress on the activities of digestive enzymes in the midgut gland,stomach and intestine ofPortunus trituberculatus,groups in different ammonia-N concentrations (0,1,5 and 20 mg·L-1)were setup in laboratory condition for comparison among the groups.Results showed that ammonia-N stress had significant effects on the activities of trypsin-like enzyme,pepsin,lipase and amylase(P<0.05).The activities of trypsin-like enzyme and pepsin in the three digestive organs showed peak changes within 48 h,and trypsin-like enzyme recovered to the control level at 48 h; while pepsin related to the ammonia concentration positively in the midgut gland became stable from 24 h; pepsin in the stomach and intestine restored to the control level at 48 h and 24 h.The activity of lipase in the midgut gland and stomach also showed peak changes within 24 h,and lipase related to the ammonia concentration positively in the midgut gland became stable;while lipase in the stomach decreased gradually and returned to the control level at 48 h.The activity of amylase in the midgut gland and intestine decreased gradually within 12 h,reached the minimum which was related to the ammonia concentration negatively at 12 h and then kept stable;while amylase in the stomach increased firstly and then decreased. Moreover,ammonia-N stress induced the activities of pepsin and lipase in the midgut gland significantly and had a significant inhibition effect on the activity of amylase in the three digestive organs at 48 h.The present study suggested that the activities of pepsin and lipase in the midgut gland and amylase in the three digestive organs could be used as evaluation indexes for the abilities of digestion and absorption of the crabs during ammonia-N stress.

Key words: ammonia-N stress;Portunus trituberculatus;digestive enzyme activity

責任編輯 于 衛(wèi)

Effects of Ammonia-N Stress on Digestive Enzyme Activities of Swimming Crab Portunus trituberculatus

XU Wu-Jie1,PAN Lu-Qing1,YUE Feng1,LI Jian2
(1.Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Yellow Sea fisheries Research Institute,CAFS,Qingdao 266071,China)

S917

A

1672-5174(2011)06-035-06

國家高技術(shù)研究發(fā)展規(guī)劃項目(2006AA10A406);教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-06-0597)資助

2010-07-27;

2010-11-08

徐武杰(1984-),男,博士生,主要從事對蝦環(huán)境生理學的研究。E-mail:phy@ouc.edu.cn

E-mail:panlq@ouc.edu.cn