趙俊峰 鄭少斌 姜耀東 趙善超 楊旭凱

(河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450002)

腎癌是老年人常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制至今不清，多數(shù)研究顯示G250(又稱MN/CAⅨ)基因可誘導細胞惡性表型〔1〕，并參與了腎臟腫瘤細胞的生長與轉移。因此通過基因重組技術抑制該基因的表達可能為腎臟腫瘤患者帶來曙光。本研究在成功構建腎癌相關抗原G250siRNA表達載體的基礎上〔2〕，利用RNA干擾(RNAi)技術阻斷G250基因表達，觀察了G250基因沉默對腎癌786-0細胞體內(nèi)成瘤及生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人腎透明細胞癌786-0細胞株(以下稱腎癌786-0細胞)及大腸桿菌DH5α由南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院泌尿外科保存。4～6周齡的12只BALB/c裸鼠為SPF級，體重15～20 g，雌雄各半，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，在南方醫(yī)院SPF實驗動物中心飼養(yǎng)。OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基及RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO公司)，lipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，G418及 DEPC(Sigma公司)，空質粒 pRNATU6.1/Neo(GenScript公司)，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、T4 DNA連接酶、T4磷酸化酶、質粒提取試劑盒、PBS(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA靶序列的設計和質粒的構建 G250 mRNA的全長序列從NCBI基因庫(Genebank登錄號:AJ010588)檢索得出。應用Primer express軟件按照siRNA的設計原則尋找含21個堿基的特異性序列。在前期實驗的基礎上，選擇最有效的G250的siRNA片段，靶位點293～313，根據(jù)pRNAT-U6.1/Neo質粒的結構，設計出特異性干擾片段的核苷酸序列:5'-GGATCCCATTTAGGCTTAACTTCAGGTATTGA TATCCGTACCTGAAGTTAAGCCTAAATTTTTTTCCAAAAGCTT-3'，5'-AAGCTTTTGGAA AAAAATTTAGGCTTAACTTCAGGTACGGATATCAATACCTGAAG TTAAGCCTAAATGGGATCC-3'。序列送由南京金思特公司合成。將退火后shRNA寡核酸雙鏈和pRNAT-U6.1/Neo酶切產(chǎn)物按3∶1混合，T4DNA連接酶27℃連接過夜，轉化感受態(tài)DH5α大腸桿菌。然后提取待測的重組質粒。酶切鑒定正確后取1 ml轉化菌液，送金思特公司測序。

1.2.2 siRNA轉染及建立穩(wěn)定干擾G250基因抗性單克隆腎癌786-0細胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640。轉染前24 h，傳代至24孔板，每孔 l.5×105個細胞。用LipofectamineTM2000進行轉染。轉染后6 h換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入選擇性培養(yǎng)基進行篩選，根據(jù)G418對腎癌786-0細胞在14 d內(nèi)的殺滅效果，我們選擇600 μg/ml作為篩選濃度。篩選培養(yǎng)2 w后可見抗性克隆長出，挑取單克隆轉入24孔板逐漸擴大培養(yǎng)，4 w左右可獲得穩(wěn)定干擾抗性單克隆。

1.2.3 實驗分組和建立腫瘤動物模型 將皮下注射轉染空質粒的腎癌細胞的(786-0/si-G250-0)裸鼠作為對照組，轉染RNA干擾片段細胞(786-0/si-G250-b)的為實驗組，每組6只。對數(shù)生長期的786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b細胞經(jīng)胰酶消化，離心收集，計數(shù)后分別重懸于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，配制成每0.1 ml含5×106個腫瘤細胞的懸液，用1 ml注射器將0.1 ml細胞懸液皮下注射于BALB/c裸鼠背部皮下，每一個部位注射5×106個細胞的懸液。

1.2.4 腫瘤生長情況監(jiān)測 自腫瘤細胞注射第10天起，每天觀察每組裸鼠成瘤時間、成瘤率，待腫瘤出現(xiàn)后每3天一次用毫米游標卡尺測量腫瘤的長、寬、高最大垂直直徑(mm)，分別以a、b、c表示，依據(jù)腫瘤體積計算公式:V(mm3)=a×b×c/2(mm3)(V:體積)，繪制腫瘤生長曲線。在成瘤后的第3周處死裸鼠，然后測量腫瘤重量，計算腫瘤生長抑制率:腫瘤生長抑制率=(1－處理組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0軟件進行處理，數(shù)據(jù)以±s表示成瘤時間、腫瘤重量的比較采取兩獨立樣本t檢驗，皮下成瘤實驗采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結果

2.1 G250基因表達沉默對腎癌786-0細胞體內(nèi)成瘤的影響

將786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b細胞接種6只裸鼠均成瘤，成瘤率分別為100%。裸鼠腫瘤出現(xiàn)時間分別為(11±1.5)d和(15±2.4)d。顯示出實驗組的成瘤時間較對照組延長，二者有統(tǒng)計學意義(t=3.381，P=0.007)，說明G250基因表達水平降低后腎癌786-0細胞在動物體內(nèi)的成瘤能力受到抑制。

2.2 G250基因表達沉默對腎癌786-0細胞移植瘤生長的影響兩組裸鼠接種G250基因表達沉默前后的腎癌786-0細胞后，皮下腫瘤生長情況見圖1。經(jīng)重復測量數(shù)據(jù)的方差分析進行統(tǒng)計學分析，兩組之間差異顯著(F=8.486，P=0.015)，細胞與時間的交互效應具有統(tǒng)計學意義(F=4.883，P=0.032)，兩組細胞7個不同時間腫瘤生長體積的差異具有統(tǒng)計學意義(F=84.836，P=0.000)，說明786-0/si-G250-0組細胞的體內(nèi)增殖能力顯著強于786-0/si-G250-b組，并隨天數(shù)增加差異加大。

圖1 G250基因表達沉默對786-0細胞體內(nèi)成瘤的影響

2.3 各組裸鼠瘤重、抑瘤率 成瘤3 w后，處死裸鼠，切取腫塊稱取重量顯示:對照和實驗組裸鼠的腫瘤重量分別為(37.353±9.332)mg、(22.224 ±5.145)mg，二者有統(tǒng)計學意義(t=3.475，P=0.006)。說明G250基因表達沉默后能抑制腎癌786-0細胞抑制鼠腫瘤的生長，G250基因表達量下降65%時對腫瘤生長抑制率為40.50%。

2.4 腫瘤組織病理改變 裸鼠成瘤組織經(jīng)HE染色病理切片鑒定均為透明細胞癌，癌細胞排列成腺管狀。癌細胞體積大，多邊形，輪廓清楚，胞漿富含脂質、糖元而淡染呈空泡狀，核稍小而深染，圓形，位于邊緣或中央，形態(tài)不規(guī)則，可見明顯的腫瘤細胞。實驗組可見少量腫瘤壞死細胞。見圖2。

圖2 G250基因沉默后786-0細胞移植腫瘤的病理學改變(HE，×200)

3 討論

腎腫瘤是泌尿系最常見的惡性腫瘤，它起病隱襲，死亡率高。2009年美國統(tǒng)計新發(fā)腎腫瘤57 760例，12 980例死亡，占所有新發(fā)實體腫瘤的3%〔3〕。腎癌的發(fā)生發(fā)展與多種癌基因及抑癌基因的異常激活、表達有關。在眾多相關研究中，G250是公認的較好的腎透明細胞癌腫瘤相關抗原，但是G250基因表達在腎透明細胞癌發(fā)病中的作用尚不明確，研究顯示G250基因可能是一種癌基因〔4〕，而且對腫瘤轉移有促進作用〔5〕。為進一步了解該基因在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，在成功設計構建、篩選及鑒定G250基因有效siRNA干擾序列的基礎上，通過人工誘導RNA干擾(RNAi)技術實現(xiàn)了對G250基因持續(xù)穩(wěn)定的抑制，觀察了G250基因表達沉默后對腎癌786-0細胞體內(nèi)成瘤及生長的影響。

研究顯示G250基因表達沉默后，腎癌786-0細胞成瘤時間較對照組明顯延長，同一時期腫瘤體積較對照組明顯減小，腫瘤重量明顯輕于接種正常腎癌786-0細胞組，G250基因沉默對腎癌786-0細胞BALB/c裸鼠皮下移植瘤的成瘤抑制率為40.5%，說明G250基因沉默能有效抑制腎癌786-0細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，不僅進一步證實G250基因在促進細胞增殖、轉化方面有重要的作用〔6〕，也提示該基因的作用可能比我們目前了解的要多，需要進一步探討。

由于觀察到G250基因表達沉默后，體內(nèi)腫瘤細胞成瘤能力明顯下降，造成腫瘤生長速度減慢，說明我們設計的小分子干擾RNA在體內(nèi)穩(wěn)定的發(fā)揮了作用，導致G250基因沉默，也證實了該技術的持久、高度特異和高效的抑制靶基因表達的優(yōu)勢〔7〕，具有潛在的臨床應用價值和前景，同時也提示G250基因有望成為基因治療的靶點。

1 Li G，F(xiàn)eng G，Gentil-Perret A，et al.CA9 gene expression in conventional renal cell carcinoma:a potential marker for prediction of early metastasis after nephrectomy〔J〕.Clin Exp Metastasis，2007;24(3):149-55.

2 趙俊峰，鄭少斌，姜耀東，等.G250基因siRNA表達載體的構建與鑒定〔J〕.山東醫(yī)藥，2008;48(1):23-5.

3 Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics 2009〔J〕.CA Cancer J Clin，2009;59(4):225-49.

4 Bismar TA，Bianco FJ，Zhang H，et al.Quantification of G250 mRNA expression in renal epithelial neoplasms by real-time reverse transcription-PCR of dissected tissue from paraffin sections〔J〕.Pathology，2003;35(6):513-7.

5 Ivanov S，Liao SY，Ivanova A，et al.Expression of hypoxia-inducible cellsurface transmembrane carbonic anhydrases in human cancer〔J〕.Am J Pathol，2001;158(3):905-19.

6 Zavada J，Zavadova Z，Pastorek J，et al.Human tumor-associated cell adhension protein MN/CA IX:identification of M75 eptope and of the region mediating cell adhension〔J〕.Br J Cancer，2000;82(11):1808-13.

7 Wullner U，Neef I，Tur MK，et al.Targeted delivery of short interfering RNAs-strategies for in vivo delivery〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2009;4(1):1-8.