馬天 宋月星 鄒先彪

(解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，北京 100048)

組織學(xué)檢查是識(shí)別真菌的一種快速、簡(jiǎn)便的方法。炎性肉芽腫和風(fēng)濕性肉芽腫的組織學(xué)評(píng)價(jià)必須包含特殊染色以確定或排除真菌和抗酸細(xì)菌的存在。在病理學(xué)日常實(shí)踐和工作中，Gomori六胺銀染色 (Gomori＇s methenamine silver stain，GMS)和糖原染色(Periodic acid-Schiff stain，PAS)是兩種較常見(jiàn)的尋找組織和細(xì)胞樣本中真菌的染色方法。真菌在組織切片中的存在是侵襲性感染的有力證據(jù)。在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中，真菌可以通過(guò)它的大小和特殊的形態(tài)得到鑒定。但由于其多樣性，僅僅使用一些常規(guī)的染色很難在組織切片中發(fā)現(xiàn)或鑒別真菌。

1 廣譜真菌染色

蘇木精-伊紅染色 (Hematoxylin-eosin stain，HE)是一種多用途的染色方法 (見(jiàn)圖1)。但診斷真菌病僅僅使用HE染色常常是不夠的，即使在高倍鏡下，也很難從組織中區(qū)分出被染色的病原菌。當(dāng)HE染色切片中的真菌稀少時(shí)，很容易被忽略。有些真菌的形態(tài)特征可能不顯明，有時(shí)甚至?xí)`診。如組織胞漿菌、皮炎芽生菌以及巴西副球孢子菌在切片中可能含有胞質(zhì)，使形態(tài)鑒定變得很困難。一些真菌變種可能有不同的大小，像大形狀的變種(非洲)組織胞漿菌和小形狀的芽生菌。一些雙相型的真菌可以在組織中形成假菌絲。有時(shí)真菌形態(tài)可以在治療后發(fā)生改變。因此，對(duì)于無(wú)法解釋的炎癥過(guò)程的組織病理學(xué)檢查，特殊染色是十分必要的［1-2］。用常見(jiàn)的特殊染色方法可以輕而易舉地顯示出絕大多數(shù)真菌，因此，GMS、Gridley＇s真菌(Gridley＇s fungus，GF)染色和 PAS 染色也被作為“廣譜”真菌染色劑。GF染色原理與PAS染色原理基本相同，都是因真菌細(xì)胞壁由糖類構(gòu)成而成陽(yáng)性反應(yīng)，只是以鉻酸而非過(guò)碘酸氧化。GMS比較適合用來(lái)初篩，因?yàn)榧词故菍?duì)變性的、無(wú)法用另外兩種染色法識(shí)別的真菌，它都能提供更好的對(duì)照(見(jiàn)圖2)。

GMS和GF染色的缺點(diǎn)是他們掩蓋了被染色真菌的天然色素，無(wú)法確定他們是無(wú)色透明的還是暗色真菌(色素)，從而無(wú)法對(duì)真菌病如暗色絲孢霉病做出確定的組織學(xué)診斷［3］。除 PAS反應(yīng)，GMS和GF染色都無(wú)法顯示真菌侵襲的炎癥反應(yīng)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，GMS同時(shí)可進(jìn)行HE復(fù)染來(lái)確定真菌及宿主反應(yīng)。岑玉蘭等［4］對(duì)25例肺隱球菌病患者的觀察中，GMS顯示菌體莢膜呈黑色，其檢出率為100%。GMS也可以染藻類 (原壁菌屬和小球藻屬)、肺囊蟲的包囊 (見(jiàn)圖3)、致病性阿米巴、大多數(shù)微孢子蟲的孢壁、胞漿內(nèi)顆粒、以色列放線菌和相關(guān)的菌屬、諾卡氏菌、大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌屬、具有多糖莢膜的非線狀菌如肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌。而確定變性的真菌成分 (如肉芽腫內(nèi)酵母組織胞漿菌)的存在需要延時(shí)硝酸銀染色。

在真菌的篩選中，PAS染色與GMS同樣有效。實(shí)際上它對(duì)真菌形態(tài)的顯示比銀染好。而PAS染色可以染色變性的真菌成分在HE染色中則可能無(wú)法顯色。

干酪性肉芽腫中的鈣化組織可通過(guò)PAS染色被發(fā)現(xiàn)，但它可能被誤認(rèn)為是酵母樣真菌的出芽酵母、莢膜或者增厚的細(xì)胞壁。GMS和GF染色是避免誤診最好的染色方法，因?yàn)殂t酸作為氧化劑可以在染色過(guò)程中溶解鈣，留下未染色的鈣化體。相反，GMS和 GF染色中可見(jiàn)的微小真菌在 PAS染色中不會(huì)出現(xiàn)，因此，GMS和PAS染色的聯(lián)合使用可以降低假陽(yáng)性率。

2 窄譜真菌染色

真菌的鑒別診斷，可能需要額外的特殊染色，使某些真菌結(jié)構(gòu)染色而其他的成分不染色，這些方法被稱為“窄譜”真菌染色［5-6］。如粘蛋白染色包括阿辛藍(lán) (alcian blue)、Mayer＇s胭脂紅染色或Southgate胭脂紅染色 (Southgate＇s mucicarmine stain)等可以輕易鑒別新生隱球菌黏液囊 (見(jiàn)圖4～5)。

這種染色方法可以將隱球菌與其他形態(tài)類似的真菌區(qū)別開(kāi)，如粗球孢子菌、念珠菌和組織胞漿。這些粘蛋白染色并非新生隱球菌的特異性染色，如皮炎芽生菌和西伯鼻孢子菌的細(xì)胞壁往往可被粘蛋白染劑不同程度地染色。然而，這兩種真菌都無(wú)包膜，且形態(tài)各異，因此通常不會(huì)被誤認(rèn)為是隱球菌。在某些情況下，組織切片中無(wú)囊體的隱球菌可能不會(huì)被粘蛋白胭脂紅完全染色，但新生隱球菌的細(xì)胞壁含有可能是黑色素前體的還原銀的物質(zhì)，它可以被黑素顆粒染劑的銀染色［7-8］。這種染劑尤其對(duì)具有以下兩個(gè)特征的隱球菌有效，即以無(wú)包囊侵襲性的酵母菌型存在的，也就是所謂的干性變種。這種隱球菌可能與具有相似形態(tài)的無(wú)囊體酵母菌混淆。在組織切片中，F(xiàn)ontana-Masson法和Lillie＇s硫酸鐵染色也可以用來(lái)定位和加強(qiáng)組織中細(xì)胞壁含黑色素和黑色素樣染色不良的皮膚暗色絲孢霉［9］。同時(shí)，PAS也可以當(dāng)作窄譜染劑使用，例如，在對(duì)出芽的小酵母菌型不同的鑒別診斷中，一個(gè)弱PAS和一個(gè)強(qiáng)CMS染色支持組織胞漿菌的診斷，因?yàn)橛肞AS染色時(shí)，念珠菌、芽生菌的微縮型、馬拉色菌的酵母型(見(jiàn)圖6)的后壁會(huì)被染色。

另一種窄譜真菌染色是Ziehl-Neelson染色。一項(xiàng)研究表明，使用ZN染色，60%的皮炎芽生菌和47%的組織胞漿菌生物(見(jiàn)圖7)呈酵母菌樣細(xì)胞的胞質(zhì)陽(yáng)性染色。染色陰性主要出現(xiàn)在隱球菌或念珠菌，抗酸染色法很難用在內(nèi)生芽孢［10］染色。

自體熒光 某些真菌或在HE染色組織切片時(shí)，螢光真菌成分在紫外線光源下［11］可見(jiàn)自體熒光。念珠菌屬、粗球孢子菌屬和曲霉菌屬能表現(xiàn)出亮綠色到黃綠色熒光［12］。當(dāng)這些真菌組織切片被PAS染色 (見(jiàn)圖8)時(shí)可以在深橘紅色背景中觀察到明亮的黃色熒光［10］。自體熒光可以幫助診斷少量的或在HE染色中染色不佳部分真菌，但這一表現(xiàn)不穩(wěn)定，不應(yīng)作為最終診斷。大多數(shù)在冷凍或石蠟包埋組織切片中的真菌被Calcofluor white(一種在紫外燈下發(fā)棉白色熒光的染色劑)非特異性染色［13］。這種快速和簡(jiǎn)單的熒光染色經(jīng)常用于新鮮冰凍組織的真菌檢查中。免疫組化染色可用于鑒別涂片標(biāo)本和福爾馬林固定標(biāo)本，石蠟包埋組織中的某些真菌。但是，這種技術(shù)只能局限性地應(yīng)用于診斷中［14］。

3 直接免疫熒光

直接免疫熒光 (immunofluoresence，IF)可提高［15］常規(guī)病理組織診斷在真菌疾病診斷中的作用。直接免疫熒光可以用于涂片標(biāo)本和福爾馬林固定石蠟包埋組織切片的定性診斷，尤其是當(dāng)新鮮組織無(wú)法進(jìn)行真菌培養(yǎng)或發(fā)現(xiàn)非特異性圖像時(shí)。亞特蘭大(美國(guó))真菌性疾病機(jī)構(gòu)、疾病控制中心和其他有組織都擁有很多對(duì)常見(jiàn)致病真菌的診斷兼具敏感性和特異性的試劑。

免疫熒光方法有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，待鑒別的真菌在HE染色和GMS染色切片后，初步鑒定可能在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。免疫熒光可以省時(shí)省力，在處理潛在感染材料時(shí)，在熒光染色前微生物在福爾馬林中被滅活，可以減少微生物的感染風(fēng)險(xiǎn)，避免污染。福爾馬林固定的組織，無(wú)論是濕組織或石蠟包埋，長(zhǎng)期儲(chǔ)存不會(huì)影響真菌抗原性。石蠟包埋組織抗原性穩(wěn)定，這可以保證在回顧性研究中或?qū)?biāo)本遠(yuǎn)途運(yùn)送至認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室后，其鑒定依然準(zhǔn)確。大部分臨床實(shí)驗(yàn)室不經(jīng)常使用免疫熒光法，因?yàn)樘厥獾闹珓?duì)日常病理診斷已經(jīng)非?？煽苛恕?/p>

圖1 曲霉的HE染色［16］ 圖2 曲霉的GMS染色［16］ 圖3 肺囊蟲的GSM染色［16］ 圖4 隱球菌的阿辛藍(lán)染色［16］ 圖5 隱球菌的PAS染色 (×1 000)［17］ 圖6 PAS染色下的馬拉色菌屬［16］ 圖7 ZN染色下的組織胞漿菌屬［16］ 圖8 PAS染色下的組織胞漿菌屬(×400)［17］Fig.1 Hematoxylin and Eosin staining of Aspergillus Fig.2 GMS staining of Aspergillus Fig.3 GMS staining of Pneumocystis jirovici Fig.4 Alcian Blue staining of Cryptococcus Fig.5 PAS staining of Cryptococcus Fig.6 PAS staining of Malassezia Fig.7 ZN staining of Histoplasma Fig.8 PAS staining of Histoplasma

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