李秀麗 田媛 史玉玲 顧俊瑛 劉至昱 李曉建 高飛

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬上海第十人民醫(yī)院皮膚科，上海 200072;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生化藥學(xué)教研室，上海 200433)

蒺藜(Tribulus terrestris)為蒺藜科蒺藜屬植物，其果實(shí)為傳統(tǒng)中藥材，具有平肝解郁、活血祛風(fēng)、明目、下氣、補(bǔ)腎益精的功用，有降壓、利尿、抗炎、抗真菌、抗腫瘤的活性。TTS-12是從刺蒺藜中提取的甾體皂苷類化合物，結(jié)構(gòu)為替告皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖 (1→2)-［β-D-吡喃木糖 (1→3)］-［β-D-吡喃葡萄糖 (1→4)］-［α-L-吡喃鼠李糖(1→2)］-β-D-吡喃半乳糖苷，具有很強(qiáng)的抗真菌活性［1-3］。生物膜是一種附著于活組織或無活力的組織表面、由菌細(xì)胞自身產(chǎn)生的ECM(extracellularmaxtrix，細(xì)胞外多聚基質(zhì))包裹的有結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體，即由ECM以及被其黏連的菌細(xì)胞構(gòu)成。近年來隱球菌生物膜及其在隱球菌感染中的作用也越來越為人們重視。隱球菌生物膜導(dǎo)致其對(duì)一些臨床常用抗真菌感染藥物產(chǎn)生高度耐藥性，導(dǎo)致許多系統(tǒng)性、反復(fù)性臨床感染。因此，本研究觀察TTS-12對(duì)新生隱球菌生物膜形成的影響并探討其可能的作用機(jī)制，為以后的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試藥及儀器

TTS-12由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥化教研室提供 (純度為99.6%)，用 DMSO配成所需濃度。MTT(Sigma公司)，2×SYBR Premix ExTaq(TaKaRa公司)。高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf)，臺(tái)式離心機(jī) (80-2B)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，LightCycler Nano實(shí)時(shí)定量RT-PCR儀 (上海銳賽科學(xué)儀器有限公司)，GeneQuantⅡ核酸定量分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 菌株及培養(yǎng)液

新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株B3501(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院真菌保藏中心)。RPMI 1640培養(yǎng)液:RPMI 1640(Gibco BRL 公司)10 g，NaHCO 32 g，嗎啡啉丙磺酸 (morpholine propanesulfonic acid，MOPS，Sigma公司)34.5 g，加蒸餾水900 mL溶解，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，蒸餾水加至1 000 mL，濾過消毒，4℃保存。YEPD培養(yǎng)液:酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水加至1 000 mL，高壓滅菌后4℃保存。

1.3 新生隱球菌生物膜的構(gòu)建［4］

將新生隱球菌接種于YEPD培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)過夜(約24 h)。次日離心收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×106/mL，加入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃靜置1 h，棄上清，重新加入RPMI 1640，37℃孵育48 h。根據(jù)重新加入 RPMI 1640(含或不含TTS-12)將細(xì)胞分為不同濃度TTS-12處理組和正常對(duì)照組。

1.4 光鏡觀察生物膜

為比較正常的及經(jīng)TTS-12(4 μg/mL)處理的新生隱球菌生物膜生物膜形態(tài)差異，將新生隱球菌在培養(yǎng)板中按照生物膜形成條件培養(yǎng)72 h后光鏡觀察。

1.5 MTT法測(cè)定生物膜的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

采用MTT法［5］檢測(cè)新生隱球菌生物膜的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。MTT法原理為活的細(xì)胞線粒體脫氫酶能夠裂解MTT的四氮唑環(huán)，使黃色的MTT變?yōu)樽仙难苌?(MTT-formazan)，通過分光光度計(jì)測(cè)定MTT-formazan吸光度，反映細(xì)胞活力。

取經(jīng) 0.5、1、2、4、8 μg/mL TTS-12 處理并培養(yǎng)72 h的新生隱球菌生物膜，PBS洗去未黏附細(xì)胞，加入含1 mg/mL MTT的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于37℃黑暗中放置4 h。加100 μL酸化異丙醇定容，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處生物膜每反應(yīng)孔中OD值，以未加TTS-12的正常培養(yǎng)細(xì)胞作為正常對(duì)照。各孔OD值與調(diào)零孔之差代表各孔生物膜的代謝活性，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)PMT4基因的表達(dá)

采用一步法抽提經(jīng) 6 組 (分別 0、0.5、1、2、4、8 μg/mL)TTS-12處理組及對(duì)照組的生物膜72 h新生隱球菌中新生隱球菌總RNA，檢測(cè)OD260和OD280值，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量RT-PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃ 10 s(變性)，60℃ 20 s(退火)，72℃15 s(延伸)，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。熔解曲線(melting curve program)使用60～95℃，加熱速率為0.1℃/s。以 β-actin為參照，結(jié)果應(yīng)用軟件LightCycler system software ver-sion 3.5(Roche Diagnostics)進(jìn)行分析?；虮磉_(dá)水平用倍數(shù)變化來表示 (2-ΔCt法)。目的基因 PMT4上游引物:5＇TTCTTTGGGACTTGTGGGAG 3＇，下游引物:5＇TTGTGGCGTAAGGTGATAGTGT 3＇。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以(±s)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來自3組平行或3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。組間比較采用兩兩比較t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 新生隱球菌生物膜的形態(tài)觀察

光鏡觀察示:經(jīng)4 μg/mL TTS-12處理后生物膜明顯受到抑制，結(jié)構(gòu)疏松(見圖1～2)。

2.2 MTT 結(jié)果

結(jié)果顯示(見表1):隨著TTS-12濃度的增加，其對(duì)生物膜形成的抑制能力增強(qiáng)，第一組0.5 μg/mL TTS-12對(duì)生物膜無明顯抑制作用 (P＜0.01)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組 (2，3，4，5組)之間及5個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間相比較有明顯劑量依賴性抑制作用(P＜0.01)。

2.3 新生隱球菌PMT4基因的表達(dá)結(jié)果

實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果(見圖3)表明:與正常對(duì)照組 (0 μg/mL)相比，0.5、1、2、4、8 μg/mL TTS-12處理組新生隱球菌PMT4基因mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且抑制作用具有劑量依賴性。

表1 不同TTS-12濃度處理的新生隱球菌生物膜MTT值Tab.1 MTT value of Cryptococcus neoformans biofilm treated with different concentrations of TTS-12

圖1 未經(jīng)4 μg/mL TTS-12處理的生物膜體外模型 圖2 經(jīng)4 μg/mL TTS-12處理后的生物膜體外模型 圖3 不同濃度TTS-12處理生物膜中新生隱球菌PMT4基因的表達(dá)結(jié)果Fig.1 Biofilm model without TTS-12 administration Fig.2 Biofilm administerled with 4 μg/mL of TTS-12 Fig.3 PMT4 gene expression of Cryptococcus neoformans biofilm treated with TTS-12 with different concentration

3 討 論

生物膜是微生物以某些惰性物質(zhì)或生物材料為依托產(chǎn)生的一種群體生長(zhǎng)方式，這種生長(zhǎng)方式有助于微生物抵御外界不利因素的影響，對(duì)抗藥物的殺傷作用，是微生物中普遍存在的生長(zhǎng)方式。生物膜的主要特點(diǎn)是明顯降低抗真菌藥物的敏感性，甚至產(chǎn)生耐藥，這也是臨床上與生物膜形成有關(guān)的感染難以治療的原因之一［1-2］。近年來，從天然產(chǎn)物中尋找新的抗真菌藥物已成為重要的研究方向，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，TTS-12具有抗真菌作用，可抑制浮游型新生隱球菌生長(zhǎng)［6-8］。

本研究結(jié)果也顯示，TTS-12對(duì)生物膜型新生隱球菌亦具有抑制作用，且抑制作用具有劑量依賴性。

新生隱球菌生物膜形成主要包括:黏附、生物膜生長(zhǎng)及成熟，其中細(xì)胞的起始黏附對(duì)生物膜的形成非常重要。Pmt4蛋白對(duì)于真菌分泌蛋白和部分膜蛋白的修飾極其重要，缺乏可導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)率下降、細(xì)胞壁不穩(wěn)定。PMT4基因在新生隱球菌生物膜形成中起重要作用，PMT4值越大，生物膜形成能力越強(qiáng)，PMT4缺陷株生物膜的代謝活性明顯低于野生株。在新生隱球菌生物膜的形成過程中起著重要的作用，該基因的缺陷可導(dǎo)致生物膜性質(zhì)顯著改變［4］。本研究測(cè)定了經(jīng)不同濃度TTS-12處理的新生隱球菌生物膜的PMT4基因，PMT4基因表達(dá)水平越低，提示PMT4表達(dá)水平下降可能是TTS-12抑制新生隱球菌生物膜形成的分子機(jī)制之一。

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