月文科 焦鋒 劉彬 尤嘉琮 周清華

近來有研究和干細(xì)胞理論表明，包括肺癌在內(nèi)的腫瘤被認(rèn)為可能是是一種干細(xì)胞疾病。目前肺癌干細(xì)胞研究的焦點(diǎn)為肺癌干細(xì)胞的分離、純化和鑒定，但肺癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物還不明確，阻礙了肺癌干細(xì)胞的研究。借鑒其他腫瘤干細(xì)胞分選標(biāo)記來分選肺癌干細(xì)胞篩選特異性低、工作量巨大。不同病理類型的肺癌可能起源于不同的肺癌干細(xì)胞， 對(duì)肺組織細(xì)胞分化的階梯層次尚不完全清楚[1-5]。這進(jìn)一步增加了肺癌干細(xì)胞篩選的難度。明確能夠有效分離和鑒定肺癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記是肺癌干細(xì)胞研究的重要前提。2008年Eramo[6]等提出CD133是一個(gè)小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中都存在的有效的肺癌干細(xì)胞分選標(biāo)記物，但對(duì)此標(biāo)記存在較大爭議且新的分選標(biāo)記層出不窮但都未有定論。

本研究應(yīng)用無血清懸浮培養(yǎng)成球技術(shù)從肺癌細(xì)胞株中富集肺癌干細(xì)胞群，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)功能研究，對(duì)建立有效分離肺癌干細(xì)胞的方法進(jìn)行探索，為后續(xù)進(jìn)一步明確肺癌干細(xì)胞標(biāo)記奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981來自天津總醫(yī)院天津市肺癌研究所。

1.1.2 試劑與材料 DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibico公司）；小牛血清（Gibico公司）；0.25%胰酶（Gibico公司）；牛血清白蛋白（BSA）；PeproTeth公司提供的上皮生長因子（Epidermal growth factor, EGF）、人胰島素樣生長因子-1（Insulin-like growth factor-1, IGF-1）、小鼠堿性成纖維生長因子（Basic fi broblast growth factor, bFGF）；DMEM/F12培養(yǎng)基中的需添加的SIGMA公司的提供的配方成分：右旋葡萄糖（G7021）、人轉(zhuǎn)鐵蛋白（TI147）、亞硒酸鈉（55261）、牛血清白蛋白（BSA）（A2153）、孕酮（P8783）、牛胰島素（10516）、腐胺（P5780）、肝素（H3149）和青鏈霉素；actuates酶（Gibico公司）；materiel（Becton Dickinson公司）；超低吸附培養(yǎng)皿和六孔板（Corning公司）；FACS Asia流式細(xì)胞儀（BD公司）；Vi-cell細(xì)胞活力分析儀（Beckman coulter公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 按照Eramo等[6]的無血清成球培養(yǎng)法，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基將L9981細(xì)胞調(diào)整至2.0×104/mL，取10 mL細(xì)胞懸液接種于超低吸附培養(yǎng)皿中，其中每毫升培養(yǎng)液液中加入20 ng/mL IGF-1，20 ng/mL EGF和10 ng/mL bFGF各20 μL。每隔2天-3天添加一次生長因子，并進(jìn)行半量換液，直至球體形成。收集成球最高時(shí)期的細(xì)胞，離心后應(yīng)用actuates酶將細(xì)胞球體消化為單細(xì)胞懸液，再次以上述密度傳代。重復(fù)上述培養(yǎng)過程，直至能夠穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞成球的過程和細(xì)胞球形態(tài)。

1.2.2 檢測肺癌L9981成球細(xì)胞的增殖能力 取無血清懸浮培養(yǎng)成球后的肺癌球體細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105/mL，采用含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在6孔板培養(yǎng)細(xì)胞。每個(gè)孔加入2 mL ，共設(shè)10個(gè)點(diǎn)，每24 h計(jì)數(shù)一個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。每24 h收集細(xì)胞消化后用Vi-cell細(xì)胞活力分析儀計(jì)數(shù)一個(gè)點(diǎn)。對(duì)照組為相同濃度的含血清貼壁培養(yǎng)的L9981細(xì)胞。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，以相對(duì)應(yīng)時(shí)間測得的細(xì)胞數(shù)為縱軸繪制生長曲線，并根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長期的倍增時(shí)間。Td=t×log2/log（Nt/N0），t代表對(duì)數(shù)生長期時(shí)間，N0和Nt分別代表對(duì)數(shù)生長期開始時(shí)間和對(duì)數(shù)生長期結(jié)束時(shí)間的細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 檢測肺癌成球細(xì)胞的侵襲能力 通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測肺癌成球細(xì)胞的侵襲能力。用Matrigel包被8 um孔徑Transwell小室，37oC溫育30 min使膠固化。在6孔板小孔內(nèi)加入1mL DMEM/F12培養(yǎng)基（含10%血清和100 ng/mL IGF-1，bFGF，EGF），將小室放入備用。用含1%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基調(diào)整待測細(xì)胞至3×105/mL，在小室中加入600 μL該濃度的細(xì)胞懸液，37oC溫育48 h后撤去小室，用專用棉簽輕輕擦去Matrigel膠和上層細(xì)胞，避免損傷基底膜，再將上室浸泡于結(jié)晶紫染色液中30 min；然后取出上室在雙蒸水中漂洗3次，晾干。用倒置熒光顯微鏡拍照（100×），計(jì)數(shù)穿過Matrigel生物膠落人小孔的細(xì)胞。

1.2.4 檢測肺癌成球細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力 將20只質(zhì)量為18 g -2 0 g，8周-10周的雌性裸鼠（SPF級(jí)，由北京腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為兩組。分別將100 μL（細(xì)胞數(shù)量分別為106，5×105，1×105， 5×104，104個(gè)）L9981球體細(xì)胞與等體積materiel混合，接種于實(shí)驗(yàn)組裸鼠腋窩皮下，對(duì)照組裸鼠皮下接種相同濃度的普通血清貼壁培養(yǎng)的L9981細(xì)胞。每周觀察一次腫瘤生長狀況，當(dāng)形成腫瘤的最大直徑大于1 cm時(shí)將全部小鼠斷頸處死，拍照后摘取皮下腫瘤，測量腫瘤大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量結(jié)果以Mean±SD表示。兩樣本的比較均采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 無血清懸浮培養(yǎng)肺癌細(xì)胞L9981球體與含血清常規(guī)培養(yǎng)L9981細(xì)胞的形態(tài)學(xué)比較 在倒置相差顯微鏡低倍鏡下，在含血清培養(yǎng)基的普通培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的L9981細(xì)胞貼壁生長，呈現(xiàn)桿狀、短梭形，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，偏心位，多偽足，細(xì)胞大小均勻（圖1A）。將L9981細(xì)胞接種在超低吸附皿中，并用含有生長因子的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞開始大量死亡。殘留細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞開始成球，可見到若干個(gè)細(xì)胞球形成（圖1B）。細(xì)胞球呈圓形或橢圓形，球體大小不等。細(xì)胞球折光性較強(qiáng)，多數(shù)懸浮細(xì)胞球不透明。球內(nèi)細(xì)胞間緊密連接，難以區(qū)分細(xì)胞間界限。有時(shí)可見兩個(gè)或以上懸浮細(xì)胞球相互結(jié)合的現(xiàn)象（圖1C）。細(xì)胞球培養(yǎng)第5-7天時(shí)，鏡下培養(yǎng)基內(nèi)可見少量細(xì)條狀物，部分連于懸浮細(xì)胞球上（圖1D）。并且成球率達(dá)到高峰期，細(xì)胞球體體積達(dá)到最大大。繼續(xù)培養(yǎng)第8-10天時(shí)，細(xì)胞球中心開始?jí)乃溃▓D1E），細(xì)胞球數(shù)目減少，且逐步變?yōu)閱渭?xì)胞懸浮狀態(tài)，并逐漸死亡（圖1F）。與貼壁腫瘤細(xì)胞相比較，懸浮腫瘤細(xì)胞生長成球較慢，花費(fèi)時(shí)間長，最少需要1周才能形成大量可見球體。

2.2 分別繪制無血清懸浮培養(yǎng)前后L9981細(xì)胞的生長曲線并計(jì)算倍增時(shí)間 無血清懸浮培養(yǎng)成球前后的L9981細(xì)胞的生長曲線均呈“S”型，符合腫瘤細(xì)胞無限細(xì)胞系的特征。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間，在有血清培養(yǎng)條件下，成球的L9981細(xì)胞和貼壁的L9981的倍增時(shí)間分別為（33.00±1.44）h和（56.05±1.95）h（表1，圖2）， 成球L9981細(xì)胞與血清貼壁培養(yǎng)L9981細(xì)胞相比生長更快。具有明顯差異（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次（圖2），無血清懸浮培養(yǎng)后的細(xì)胞與血清貼壁生長的細(xì)胞相比，其增殖能力明顯提高。

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)（100×）穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)無血清懸浮培養(yǎng)后的L9981組平均視野中的侵襲細(xì)胞數(shù)目為282.75個(gè)（圖3A，表2），而含血清貼壁培養(yǎng)的L9981細(xì)胞侵襲穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)目為55.42個(gè)（圖3B，表2）。L9981球體細(xì)胞在相同條件下穿過Matrigel膠進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量是普通貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的5倍以上，顯示了無血清懸浮培養(yǎng)成球富集的細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性。

2.4 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果 接種懸浮培養(yǎng)成球的L9981細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組裸鼠3周后開始成瘤，第6周處死時(shí)，共有5只裸鼠成瘤，成瘤率為5/10（表3，圖4）。接種含血清貼壁培養(yǎng)L9981細(xì)胞的裸鼠始終均未見成瘤，成瘤率為0/10。無血清懸浮培養(yǎng)肺癌細(xì)胞球的體內(nèi)成瘤能力顯著高于血清培養(yǎng)貼壁肺癌細(xì)胞（P＜0.05）。

表 1 L9981球體細(xì)胞和含血清貼壁培養(yǎng)的L9981細(xì)胞倍增時(shí)間比較（ Mean±SD，n=3）Tab 1 The comparation of Cell doubling time between L9981 spheres cells and L9981 in serum adherent culture

表 2 L9981球體細(xì)胞和含血清貼壁培養(yǎng)的L9981細(xì)胞侵襲性比較（ Mean±SD，n=3）Tab 2 The comparation of invasion between L9981 spheres cells and L9981 in serum adherent culture

圖 1 無血清懸浮培養(yǎng)L9981球體細(xì)胞和血清貼壁生長L9981細(xì)胞在顯微鏡下形態(tài)學(xué)差異。A：L9981含血清貼壁培養(yǎng)后形態(tài)（100×）；B：L9981無血清培養(yǎng)第3天形態(tài)（100×）；C：L9981無血清培養(yǎng)第5天形態(tài)（100×）D：L9981無血清培養(yǎng)第6天形態(tài)（200×）；E：L9981無血清培養(yǎng)第8天形態(tài)（100×）（細(xì)胞球壞死崩解）；F：L9981無血清培養(yǎng)第10天形態(tài)（100×）（細(xì)胞球壞死崩解成單細(xì)胞狀態(tài)）。Fig 1 Morphology of the L9981 spheres cells in serum-free suspension culture is different from the L9981 cells in serum adherent morphological under the microscope. A: the morphology of L9981 cell in serum adherent culture (100 ×); B: the morphology of L9981 cell in serum-free suspension on the third day (100 ×); C: the morphology of L9981 cell in serum-free suspension on the fifth day (100 ×); D:the morphology of L9981 cell in serum-free suspension on the sixth day (200 ×); E: the morphology of L9981 cell in serum-free suspension on the eighth day (the spheres in necrosis and Collapse) (100 ×);F: the morphology of L9981 cell in serum-free suspension On the tenth day ((the spheres in single-cell state) (100 ×).

圖 2 無血清懸浮培養(yǎng)L9981球體細(xì)胞與血清貼壁培養(yǎng)L9981細(xì)胞株的生長曲線比較（P＜0.05）Fig 2 Cell growth curve of L9981 spheres cells in serum-free suspension culture is compared with that of L9981 cell in serum adherent culture (P＜0.05)

圖 3 無血清懸浮培養(yǎng)L9981球體細(xì)胞株(A)與血清貼壁培養(yǎng)L9981(B)細(xì)胞株的transwell侵襲性比較（P＜0.05）Fig 3 The comparison of transwell chamber invasion between L9981 spheres cells in serumfree suspension culture (A) and L9981 in serum adherent culture(B)（P＜0.05）

圖 4 裸鼠成瘤情況。A：B組裸鼠接種血清貼壁培養(yǎng)細(xì)胞；B：A組活體裸鼠成瘤后均未成瘤可見皮下腫瘤；C：A組裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤的摘?。籇：摘取后腫瘤的形態(tài)和大小。Fig 4 Transpntation tumor of mice. A: No tumor formation is observed in B groups of nude mice inoculated with L9981 cells in in serum adherent culture; B: A group of nude mice subcutaneous tumor is observed; C: the removal of the tumor generated in A group of nude mice;D: Morphology of the Transpntation tumor of mice is observed and tumor size is measured.

表 3 L9981球體細(xì)胞和含血清貼壁培養(yǎng)的L9981細(xì)胞的成瘤性比較Tab 3 The comparison of transpntation tumor of mice between L9981 spheres cells and L9981 cells in serum adherent culture

3 討論

腫瘤干細(xì)胞理論為更好地治療腫瘤帶來了曙光[7-10]。肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤，迫切需要研究肺癌干細(xì)胞的生物學(xué)功能，為肺癌的治療奠定理論基礎(chǔ)。當(dāng)前肺癌干細(xì)胞研究的焦點(diǎn)是分離和鑒定肺癌干細(xì)胞。一般方法是采用流式細(xì)胞儀分選可能的肺癌細(xì)胞亞群，再進(jìn)行生物學(xué)鑒定，以證明其干細(xì)胞特性。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選方法，Eramo等[6]提出CD133是一個(gè)有效的肺癌干細(xì)胞分選標(biāo)記物，Ho等[11]利用SP（side popμlation）法篩選出具有部分干細(xì)胞特性肺癌細(xì)胞。近幾年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)ALDH、ALDH1、ALDH3A1、ASCL1和ALDH1A1可能是肺癌干細(xì)胞的篩選標(biāo)記[12-19]。Leung等[20]發(fā)現(xiàn)NSCLC表達(dá)CD44陽性群（CD44+）肺癌細(xì)胞可能富含肺癌干細(xì)胞。Gutova等[21]發(fā)現(xiàn)SCLC中 尿激酶纖溶酶原激活物受體陽性（uPAR+）細(xì)胞群可能含有肺癌干細(xì)胞，Koch等[22]發(fā)現(xiàn)PODXL-1（足糖萼蛋白樣蛋白1）和 Bmi1是SCLC中可能的肺癌干細(xì)胞分選標(biāo)記。也有研究[23]顯示CD133(+)/nestin(+)是可能的肺癌干細(xì)胞標(biāo)記。但是，以上發(fā)現(xiàn)的可能肺癌干細(xì)胞篩選標(biāo)記均存在爭議。Meng的研究[24,25]提出僅表達(dá)CD133尚不能作為肺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物。Cui等[26]研究認(rèn)為CD133僅僅是SCLC中肺癌干細(xì)胞的一個(gè)臨時(shí)標(biāo)記，而并不能作為非NSCLC中肺癌干細(xì)胞的標(biāo)記。

上述研究均是借鑒已知的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物來分離出一個(gè)肺癌細(xì)胞亞群，再鑒定其是否具有干細(xì)胞特性。但該方法存在明顯不足之處，此方法借鑒其他腫瘤干細(xì)胞或正常肺干細(xì)胞的篩選標(biāo)記來分選肺癌干細(xì)胞，分離出來細(xì)胞亞群，可能只是一部分類似祖細(xì)胞的細(xì)胞群——處于肺癌細(xì)胞發(fā)育過程中的比較靠近腫瘤細(xì)胞起源處的細(xì)胞，并沒有篩選到真正的肺癌干細(xì)胞。理論上只有分離得到的單個(gè)的能致瘤的肺癌細(xì)胞才是真正的肺癌干細(xì)胞。目前利用已有的各腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記篩選出來的細(xì)胞都不能滿足這個(gè)要求。同時(shí)，雖然這種分選方法是當(dāng)前研究腫瘤干細(xì)胞的主流方法，但是一旦選取錯(cuò)誤的分選標(biāo)記進(jìn)行分選，后續(xù)再驗(yàn)證這些篩選出的錯(cuò)誤細(xì)胞亞群將毫無意義。整個(gè)分選過程中實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，需要培養(yǎng)大量細(xì)胞，造成大量資源的浪費(fèi)。在干細(xì)胞分選標(biāo)記沒有明確的情況下，這種分選方法并不足取。

我們依據(jù)腫瘤干細(xì)胞具有能在無血清懸浮培養(yǎng)條件下富集的特性，采用添加生長因子的無血清培養(yǎng)基對(duì)L9981進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得肺癌細(xì)胞球體。然后對(duì)分離到的肺癌細(xì)胞球體進(jìn)行生物學(xué)功能鑒定，并鑒定分選到的細(xì)胞亞群是否是具有肺癌干細(xì)胞特性的細(xì)胞。此方法無需大量費(fèi)用和復(fù)雜的細(xì)胞分離純化過程。

癌細(xì)胞起源于上皮細(xì)胞，成貼壁生長，一旦阻止其貼壁，癌細(xì)胞將很快凋亡。而在無血清條件下，加入EGF，bFGF等細(xì)胞生長因子可以誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞懸浮生長成球體。無血清懸浮培養(yǎng)作為一種體外富集干細(xì)胞的方法，最早見于神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)[27]，Ponti等[8]懸浮培養(yǎng)原代人乳腺癌細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)它們均可在無血清條件下非粘附生長，形成乳腺癌細(xì)胞球，且可體外連續(xù)擴(kuò)增傳代，具有干細(xì)胞特性。Dontu等[28,29]在超低吸附培養(yǎng)皿中，采用含EGF和B27生長因子的無血清培養(yǎng)基，直接誘導(dǎo)正常乳腺干細(xì)胞及乳腺癌干細(xì)胞形成球體。也有研究者[30,31]通過此方法培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞以獲得穩(wěn)定的乳腺癌干細(xì)胞/祖細(xì)胞群。在添加生長因子的無血清培養(yǎng)條件下，細(xì)胞懸浮生長形成“球狀”結(jié)構(gòu)，從而限制了細(xì)胞的分化，可以達(dá)到富集干細(xì)胞的目的，并且球體細(xì)胞可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

腫瘤細(xì)胞對(duì)無血清培養(yǎng)條件有一個(gè)適應(yīng)過程，這一過程本身就是一種篩選。在缺少血清的環(huán)境中，相對(duì)分化成熟的細(xì)胞由于耐受不了長期的懸浮生長而凋亡，而相對(duì)未分化的細(xì)胞則存活下來并開始增殖。必須保證懸浮成球培養(yǎng)在超低吸附環(huán)境中進(jìn)行，因?yàn)樵跓o血清普通培養(yǎng)皿培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍然不同程度的貼壁生長不能獲得球體。作為一種初步分離、擴(kuò)增干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，無血清培養(yǎng)無疑具有簡便、快速、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測。相對(duì)于含血清培養(yǎng)而言，無血清懸浮培養(yǎng)基具有更高的成分限定性、各批產(chǎn)品之間更高的產(chǎn)品質(zhì)量一致性、簡化提純和下游生產(chǎn)過程、便于控制培養(yǎng)的生理環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。最新文獻(xiàn)報(bào)道[30,32]顯示，采取低血清濃度進(jìn)行干細(xì)胞的篩選取得了成功。

細(xì)胞對(duì)無血清培養(yǎng)條件有著較為嚴(yán)格的要求。為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，必須保證使種入的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長中期，活細(xì)胞率大于90%，細(xì)胞初次以較高的濃度接種。同時(shí)必須加入EGF和bFGF等生長因子，才能誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入增殖周期大量擴(kuò)增。缺乏這些因子則細(xì)胞長期處于該培養(yǎng)條件下不增殖或增殖緩慢。本研究采用的是2×104起始濃度種入無血清低吸附培養(yǎng)皿中，與Eramo的實(shí)驗(yàn)相比，我們額外加入了IGF-1，產(chǎn)生的球體更多更明顯。

腫瘤細(xì)胞動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)是檢驗(yàn)?zāi)[瘤干細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中，在10%血清培養(yǎng)基中接種相同濃度的細(xì)胞時(shí)，L9981球體細(xì)胞比血清貼壁培養(yǎng)的L9981細(xì)胞生長更加迅速，且細(xì)胞倍增時(shí)間明顯縮短（P＜0.05）。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示L9981球體細(xì)胞在相同條件下穿過Matrigel膠進(jìn)入下層的細(xì)胞數(shù)量是普通貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的5倍以上。L9981球體細(xì)胞的侵襲能力顯著高于普通血清貼壁培養(yǎng)的L9981細(xì)胞（P＜0.05），致瘤性實(shí)驗(yàn)比較顯示僅1×105個(gè)L9981球體細(xì)胞即可成瘤，而2×106個(gè)普通血清貼壁培養(yǎng)的L9981細(xì)胞才能成瘤，兩者相差20倍，具有明顯差異（P＜0.05）。這些結(jié)果提示L9981球體細(xì)胞中確實(shí)富集了肺癌干細(xì)胞，也提示無血清懸浮培養(yǎng)只是富集了含干細(xì)胞/祖細(xì)胞的一個(gè)異質(zhì)群，如果全部L9981球體細(xì)胞都是肺癌干細(xì)胞，那它們和普通腫瘤細(xì)胞相比成瘤性差異會(huì)更大。

總之，無血清懸浮培養(yǎng)作為一種富集干細(xì)胞的方法，該法得到的細(xì)胞仍然只是一個(gè)富含干細(xì)胞或祖細(xì)胞在內(nèi)的異質(zhì)性的細(xì)胞。肺癌干細(xì)胞處于肺癌腫瘤細(xì)胞發(fā)育的源頭部位且單個(gè)肺癌干細(xì)胞就具有很強(qiáng)的致瘤能力。本研究雖然證實(shí)了人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981中存在肺癌干細(xì)胞或者肺癌干細(xì)胞樣的細(xì)胞。但是也迫切需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測這些球體細(xì)胞表面蛋白標(biāo)記的表達(dá)，最終明確真正的篩選標(biāo)記以分離肺癌干細(xì)胞。到底哪一個(gè)標(biāo)記適合用于篩選肺癌干細(xì)胞，這需要我們進(jìn)一步研究。