齊恩芳，王一航，李高峰，賈小霞，文國(guó)宏

（甘肅省農(nóng)科院馬鈴薯研究所，蘭州，730070）

馬鈴薯是無(wú)性繁殖作物，其實(shí)生種子性狀高度分離不宜作為種質(zhì)保存，而以塊莖方式 “春種，秋收，冬窖藏”經(jīng)大田繼代繁殖保存要花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，并占用一定面積的土地，而且由于連年田間種植和冬貯，導(dǎo)致各種病害不斷侵染和病毒積累，造成種質(zhì)資源退化、混雜或遺失，同時(shí)，也不便于種質(zhì)的管理、交換與發(fā)放。利用組織培養(yǎng)技術(shù)保存可避免田間病蟲害的侵害，減少種質(zhì)資源流失，又具有占用空間小，便于交流等優(yōu)點(diǎn)。但常規(guī)組織培養(yǎng)保存繼代時(shí)間短（30 d左右），多次繼代可能造成交叉污染，消耗人力物力，且易引發(fā)遺傳變異。

添加有高滲化合物的培養(yǎng)基常用于植物材料的長(zhǎng)期保存。這類化合物提高了培養(yǎng)基的滲透勢(shì)負(fù)值，造成水分逆境，降低細(xì)胞膨壓，使細(xì)胞吸水困難，新陳代謝活動(dòng)減弱，從而延緩細(xì)胞生長(zhǎng)。不同的高滲化合物適于不同的植物種類，50～90 g/L高濃度蔗糖延長(zhǎng)了百合試管苗的保存時(shí)間[1]，櫻桃、柿和君遷子的試管苗在添加甘露醇的培養(yǎng)基中延長(zhǎng)保存效果較好，而高濃度甘露醇取代蔗糖不利于柑橘種質(zhì)離體保存[2～4]。本研究以馬鈴薯試管苗為試材，探討蔗糖和甘露醇不同濃度配比對(duì)延緩試管苗生長(zhǎng)的效應(yīng)，以期為馬鈴薯試管苗種質(zhì)保存提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為菲多利馬鈴薯試管苗。

1.2 試驗(yàn)方法

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的蔗糖與甘露醇（MNT），形成蔗糖與甘露醇不同濃度配比的組合13個(gè) （表1）。培養(yǎng)基中瓊脂粉0.45%，pH值5.8，分裝于 100 mL三角瓶中，每瓶 40 mL，121℃，1.06 kg/cm2滅菌20 min。每瓶接種5個(gè)帶腋芽的無(wú)菌試管苗莖段，每處理18瓶，在自然光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度變化范圍5～30℃。每3個(gè)月統(tǒng)計(jì)1次試管苗的成活率（植株開始萎蔫或葉片開始發(fā)黃脫落記為死亡），保存3個(gè)月時(shí)測(cè)定試管苗的株高、結(jié)薯數(shù)。文中數(shù)據(jù)采用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蔗糖對(duì)試管苗保存的影響

表1 蔗糖與甘露醇不同濃度配比組合

隨培養(yǎng)基蔗糖濃度增加，試管苗生長(zhǎng)減緩，由于滲透壓增大，水分蒸發(fā)較少，蔗糖濃度較高時(shí)，后期培養(yǎng)基剩余較多。生長(zhǎng)3個(gè)月時(shí)，3種蔗糖濃度對(duì)試管苗的生長(zhǎng)影響差異顯著，蔗糖濃度越高，試管苗生長(zhǎng)就越緩慢（圖1），80 g/L蔗糖的處理效果顯著。

蔗糖濃度對(duì)試管苗存活率的影響見圖2，隨著保存時(shí)間的持續(xù)，蔗糖濃度越高，試管苗保存時(shí)間越長(zhǎng)。不加蔗糖和添加30 g/L蔗糖的CK，試管苗前期生長(zhǎng)良好，植株健壯。不加蔗糖的試管苗在1個(gè)月后生長(zhǎng)減緩，長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，植株基部部分葉片逐漸失綠白化，隨后由于養(yǎng)分缺失，3個(gè)月時(shí)全部死亡；而CK植株因過(guò)度生長(zhǎng)逐漸衰老，基部葉片干枯，莖段中部長(zhǎng)滿氣生根，只有植株頂梢部分可用，3個(gè)月時(shí)有部分死亡，在6個(gè)月時(shí)全部死亡。添加60 g/L蔗糖的處理4和80 g/L蔗糖的處理8，試管苗前期生長(zhǎng)較好，3個(gè)月后存活率為100%，有試管薯形成，但葉片呈黃綠色；保存6個(gè)月時(shí)，處理4有22.2%死亡，處理8全部成活；至9個(gè)月時(shí)，處理4成活率為33.3%，平均結(jié)薯0.44個(gè)，處理8成活率為55.6%，平均結(jié)薯1.06個(gè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，提高培養(yǎng)基中的蔗糖濃度具有減緩馬鈴薯試管苗生長(zhǎng)，延長(zhǎng)保存時(shí)間的作用，60～80 g/L的蔗糖可使馬鈴薯試管苗比對(duì)照延長(zhǎng)存活3～6個(gè)月，可用于其短期（如越夏）保存。

2.2 不同甘露醇濃度對(duì)試管苗保存的影響

甘露醇能夠提高培養(yǎng)基滲透壓，從而抑制試管苗的生長(zhǎng)[5]。在蔗糖濃度為30 g/L的培養(yǎng)基中加入不同濃度的甘露醇，馬鈴薯試管苗的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，試管苗保存時(shí)間得到不同程度的延長(zhǎng)（圖3）。沒有添加甘露醇處理的試管苗在培養(yǎng)3個(gè)月時(shí)株高達(dá)11.24 cm，加入甘露醇后因水分和養(yǎng)分吸收受阻，植株生長(zhǎng)減慢，株高受到抑制，且甘露醇對(duì)莖高的抑制作用與甘露醇濃度呈正相關(guān)。當(dāng)甘露醇濃度為10 g/L時(shí)，試管苗生長(zhǎng)比對(duì)照慢，但經(jīng)方差分析其差異不顯著，當(dāng)甘露醇濃度達(dá)到20 g/L以上時(shí)，其抑制生長(zhǎng)的效果與其他處理差異達(dá)到顯著水平。

不同甘露醇濃度處理除對(duì)試管苗生長(zhǎng)存在抑制作用外，對(duì)試管苗的存活率也有較大影響（圖4）。沒有添加甘露醇處理的試管苗保存到3個(gè)月時(shí)開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，培養(yǎng)基中添加甘露醇的處理試管苗存活率則高達(dá)100%，當(dāng)保存時(shí)間延長(zhǎng)至6個(gè)月時(shí)，沒有添加甘露醇的處理試管苗全部死亡，而培養(yǎng)基中添加甘露醇的處理1～3的存活率則分別為77.8%，94.4%，72.2%，說(shuō)明甘露醇對(duì)于提高試管苗的存活率十分有效。

圖1 不同濃度蔗糖對(duì)馬鈴薯試管苗株高和結(jié)薯數(shù)的影響

圖2 不同濃度蔗糖和保存時(shí)間對(duì)馬鈴薯試管苗存活率的影響

圖3 不同濃度甘露醇對(duì)馬鈴薯試管苗株高的影響

圖4 不同濃度甘露醇和保存時(shí)間對(duì)馬鈴薯試管苗存活率的影響

2.3 不同濃度蔗糖與甘露醇配比對(duì)試管苗保存的影響

由圖5可看出，低濃度（30 g/L）蔗糖添加不同濃度甘露醇后對(duì)試管苗的抑制作用均較弱，雖然6個(gè)月后存活率均在70%以上，但植株衰老，僅頂梢部分呈嫩綠色，且9個(gè)月后均無(wú)成活；中等濃度（60 g/L）蔗糖添加10，20 g/L甘露醇的試管苗保存9個(gè)月后仍有50%以上的存活率，但添加30 g/L甘露醇的處理7試管苗保存9個(gè)月時(shí)存活率僅為16.7%；高濃度（80 g/L）蔗糖對(duì)試管苗的抑制作用較為明顯，其中與30 g/L甘露醇組合的滲透脅迫最為強(qiáng)烈，試管苗接種20 d后基部葉片黃化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，萌發(fā)的腋芽也逐漸黃化死亡，9個(gè)月后全部死亡，而處理9，10試管苗保存9個(gè)月后分別保持了66.7%和83.3%的存活率。試驗(yàn)結(jié)果表明，較低濃度的甘露醇（10 g/L和20 g/L）結(jié)合中高濃度的蔗糖有利于試管苗的保存，以20 g/L甘露醇+80 g/L蔗糖處理保存效果明顯。

處理5，6，9，10間試管苗株高差異顯著，其中處理5，6的試管苗顯著高于處理9，10的，說(shuō)明蔗糖和甘露醇綜合濃度較高，即滲透壓較高時(shí)，馬鈴薯試管苗株高相對(duì)較低。高濃度蔗糖可誘導(dǎo)試管苗結(jié)薯，試管薯在保存3個(gè)月后形成，處理9，10的平均結(jié)薯數(shù)顯著高于處理5，6，達(dá)到1個(gè)/株左右，在保存后期植株死亡后，試管薯轉(zhuǎn)接至快繁培養(yǎng)基上可形成正常植株繼續(xù)生長(zhǎng)。

圖5 不同配比蔗糖和甘露醇對(duì)馬鈴薯試管苗存活率的影響

圖6 不同配比蔗糖和甘露醇對(duì)馬鈴薯試管苗株高和結(jié)薯數(shù)的影響

3 小結(jié)與討論

通過(guò)提高培養(yǎng)基的滲透壓可延緩植物生長(zhǎng)。常用滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)有甘露醇、蔗糖等[6～8]。相對(duì)于蔗糖，甘露醇不易被植物吸收，在種質(zhì)保存應(yīng)用中，甘露醇的作用是提高培養(yǎng)基滲透壓，從而抑制保存材料的生長(zhǎng)。甘露醇對(duì)外植體生長(zhǎng)的抑制作用持久，其作用機(jī)理是消除了細(xì)胞擴(kuò)大生長(zhǎng)所必需的膨壓，同時(shí)細(xì)胞壁酶活性也受到抑制，使細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，減少了養(yǎng)分消耗[9]。Withers等[10]和Ng等[11]使用濃度為4%甘露醇來(lái)保存種質(zhì)，在8℃培養(yǎng)溫度下，可使繼代周期超過(guò)1 a。甘露醇雖然能夠延緩試管苗的生長(zhǎng)，但是，濃度高于5%時(shí)，會(huì)造成植物生活力下降[12，13]。本試驗(yàn)中，試管苗在無(wú)甘露醇的培養(yǎng)基中保存6個(gè)月時(shí)全部死亡，添加10～30 g/L的甘露醇后，存活率大大提高，均達(dá)到70%以上，能保存到9個(gè)月以上。

離體培養(yǎng)條件下,糖類物質(zhì)是試管苗生存和生長(zhǎng)的主要碳源，同時(shí)可維持培養(yǎng)基的滲透壓。本試驗(yàn)的結(jié)果也充分證明了這一點(diǎn)，不加蔗糖的處理，因碳源不足試管苗生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)勢(shì)弱。若植株靠自身微弱的光合作用合成少量的碳水化合物來(lái)維持其生長(zhǎng)發(fā)育，一般保存時(shí)間不超過(guò)3個(gè)月。隨著附加蔗糖濃度由30 g/L增加到80 g/L，蔗糖表現(xiàn)出明顯的由作為碳源向作為滲透物質(zhì)的過(guò)渡。當(dāng)蔗糖濃度為30 g/L時(shí)，碳源充足，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，即使附加10～30 g/L的甘露醇也不能有效地減緩其生長(zhǎng)速度，保存到6個(gè)月時(shí)試管苗已嚴(yán)重衰老，死亡嚴(yán)重，9個(gè)月后全部枯死；而當(dāng)蔗糖濃度增加到80 g/L，并配合20 g/L甘露醇時(shí)，試管苗生長(zhǎng)極其緩慢，保存9個(gè)月后仍有83.3%的存活率。

本研究結(jié)果表明，馬鈴薯試管苗的離體保存完全可以達(dá)到短期保存的目的。在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的蔗糖和甘露醇，利用蔗糖在培養(yǎng)基中的雙重作用及甘露醇的滲透調(diào)節(jié)作用，在添加80 g/L蔗糖和20 g/L甘露醇的培養(yǎng)基中取得了良好的保存效果，能最大程度地延緩馬鈴薯試管苗的生長(zhǎng)，繼代周期在9個(gè)月以上。但為了種質(zhì)安全，保存材料應(yīng)適當(dāng)增加備份，每2～3個(gè)月檢查1次，當(dāng)存活苗顯著減少時(shí)，應(yīng)及時(shí)恢復(fù)培養(yǎng)，使試管苗恢復(fù)生長(zhǎng)活力，然后再進(jìn)行下一周期的保存。另外種質(zhì)離體保存除利用調(diào)節(jié)蔗糖濃度與添加甘露醇等措施外，還常與低溫處理等結(jié)合，因此，應(yīng)深入開展將低溫處理、調(diào)節(jié)蔗糖濃度及添加甘露醇等結(jié)合對(duì)馬鈴薯離體保存影響的研究，以期進(jìn)一步延長(zhǎng)保存的時(shí)間、提高成活率。

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