齊恩芳，王一航，李高峰，賈小霞，文國宏

（甘肅省農(nóng)科院馬鈴薯研究所，蘭州，730070）

馬鈴薯是無性繁殖作物，其實(shí)生種子性狀高度分離不宜作為種質(zhì)保存，而以塊莖方式 “春種，秋收，冬窖藏”經(jīng)大田繼代繁殖保存要花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，并占用一定面積的土地，而且由于連年田間種植和冬貯，導(dǎo)致各種病害不斷侵染和病毒積累，造成種質(zhì)資源退化、混雜或遺失，同時(shí)，也不便于種質(zhì)的管理、交換與發(fā)放。利用組織培養(yǎng)技術(shù)保存可避免田間病蟲害的侵害，減少種質(zhì)資源流失，又具有占用空間小，便于交流等優(yōu)點(diǎn)。但常規(guī)組織培養(yǎng)保存繼代時(shí)間短（30 d左右），多次繼代可能造成交叉污染，消耗人力物力，且易引發(fā)遺傳變異。

添加有高滲化合物的培養(yǎng)基常用于植物材料的長期保存。這類化合物提高了培養(yǎng)基的滲透勢(shì)負(fù)值，造成水分逆境，降低細(xì)胞膨壓，使細(xì)胞吸水困難，新陳代謝活動(dòng)減弱，從而延緩細(xì)胞生長。不同的高滲化合物適于不同的植物種類，50～90 g/L高濃度蔗糖延長了百合試管苗的保存時(shí)間[1]，櫻桃、柿和君遷子的試管苗在添加甘露醇的培養(yǎng)基中延長保存效果較好，而高濃度甘露醇取代蔗糖不利于柑橘種質(zhì)離體保存[2～4]。本研究以馬鈴薯試管苗為試材，探討蔗糖和甘露醇不同濃度配比對(duì)延緩試管苗生長的效應(yīng)，以期為馬鈴薯試管苗種質(zhì)保存提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為菲多利馬鈴薯試管苗。

1.2 試驗(yàn)方法

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的蔗糖與甘露醇（MNT），形成蔗糖與甘露醇不同濃度配比的組合13個(gè) （表1）。培養(yǎng)基中瓊脂粉0.45%，pH值5.8，分裝于 100 mL三角瓶中，每瓶 40 mL，121℃，1.06 kg/cm2滅菌20 min。每瓶接種5個(gè)帶腋芽的無菌試管苗莖段，每處理18瓶，在自然光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度變化范圍5～30℃。每3個(gè)月統(tǒng)計(jì)1次試管苗的成活率（植株開始萎蔫或葉片開始發(fā)黃脫落記為死亡），保存3個(gè)月時(shí)測(cè)定試管苗的株高、結(jié)薯數(shù)。文中數(shù)據(jù)采用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蔗糖對(duì)試管苗保存的影響

表1 蔗糖與甘露醇不同濃度配比組合

隨培養(yǎng)基蔗糖濃度增加，試管苗生長減緩，由于滲透壓增大，水分蒸發(fā)較少，蔗糖濃度較高時(shí)，后期培養(yǎng)基剩余較多。生長3個(gè)月時(shí)，3種蔗糖濃度對(duì)試管苗的生長影響差異顯著，蔗糖濃度越高，試管苗生長就越緩慢（圖1），80 g/L蔗糖的處理效果顯著。

蔗糖濃度對(duì)試管苗存活率的影響見圖2，隨著保存時(shí)間的持續(xù)，蔗糖濃度越高，試管苗保存時(shí)間越長。不加蔗糖和添加30 g/L蔗糖的CK，試管苗前期生長良好，植株健壯。不加蔗糖的試管苗在1個(gè)月后生長減緩，長勢(shì)變?nèi)?，植株基部部分葉片逐漸失綠白化，隨后由于養(yǎng)分缺失，3個(gè)月時(shí)全部死亡；而CK植株因過度生長逐漸衰老，基部葉片干枯，莖段中部長滿氣生根，只有植株頂梢部分可用，3個(gè)月時(shí)有部分死亡，在6個(gè)月時(shí)全部死亡。添加60 g/L蔗糖的處理4和80 g/L蔗糖的處理8，試管苗前期生長較好，3個(gè)月后存活率為100%，有試管薯形成，但葉片呈黃綠色；保存6個(gè)月時(shí)，處理4有22.2%死亡，處理8全部成活；至9個(gè)月時(shí)，處理4成活率為33.3%，平均結(jié)薯0.44個(gè)，處理8成活率為55.6%，平均結(jié)薯1.06個(gè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，提高培養(yǎng)基中的蔗糖濃度具有減緩馬鈴薯試管苗生長，延長保存時(shí)間的作用，60～80 g/L的蔗糖可使馬鈴薯試管苗比對(duì)照延長存活3～6個(gè)月，可用于其短期（如越夏）保存。

2.2 不同甘露醇濃度對(duì)試管苗保存的影響

甘露醇能夠提高培養(yǎng)基滲透壓，從而抑制試管苗的生長[5]。在蔗糖濃度為30 g/L的培養(yǎng)基中加入不同濃度的甘露醇，馬鈴薯試管苗的生長受到不同程度的抑制，試管苗保存時(shí)間得到不同程度的延長（圖3）。沒有添加甘露醇處理的試管苗在培養(yǎng)3個(gè)月時(shí)株高達(dá)11.24 cm，加入甘露醇后因水分和養(yǎng)分吸收受阻，植株生長減慢，株高受到抑制，且甘露醇對(duì)莖高的抑制作用與甘露醇濃度呈正相關(guān)。當(dāng)甘露醇濃度為10 g/L時(shí)，試管苗生長比對(duì)照慢，但經(jīng)方差分析其差異不顯著，當(dāng)甘露醇濃度達(dá)到20 g/L以上時(shí)，其抑制生長的效果與其他處理差異達(dá)到顯著水平。

不同甘露醇濃度處理除對(duì)試管苗生長存在抑制作用外，對(duì)試管苗的存活率也有較大影響（圖4）。沒有添加甘露醇處理的試管苗保存到3個(gè)月時(shí)開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，培養(yǎng)基中添加甘露醇的處理試管苗存活率則高達(dá)100%，當(dāng)保存時(shí)間延長至6個(gè)月時(shí)，沒有添加甘露醇的處理試管苗全部死亡，而培養(yǎng)基中添加甘露醇的處理1～3的存活率則分別為77.8%，94.4%，72.2%，說明甘露醇對(duì)于提高試管苗的存活率十分有效。

圖1 不同濃度蔗糖對(duì)馬鈴薯試管苗株高和結(jié)薯數(shù)的影響

圖2 不同濃度蔗糖和保存時(shí)間對(duì)馬鈴薯試管苗存活率的影響

圖3 不同濃度甘露醇對(duì)馬鈴薯試管苗株高的影響

圖4 不同濃度甘露醇和保存時(shí)間對(duì)馬鈴薯試管苗存活率的影響

2.3 不同濃度蔗糖與甘露醇配比對(duì)試管苗保存的影響

由圖5可看出，低濃度（30 g/L）蔗糖添加不同濃度甘露醇后對(duì)試管苗的抑制作用均較弱，雖然6個(gè)月后存活率均在70%以上，但植株衰老，僅頂梢部分呈嫩綠色，且9個(gè)月后均無成活；中等濃度（60 g/L）蔗糖添加10，20 g/L甘露醇的試管苗保存9個(gè)月后仍有50%以上的存活率，但添加30 g/L甘露醇的處理7試管苗保存9個(gè)月時(shí)存活率僅為16.7%；高濃度（80 g/L）蔗糖對(duì)試管苗的抑制作用較為明顯，其中與30 g/L甘露醇組合的滲透脅迫最為強(qiáng)烈，試管苗接種20 d后基部葉片黃化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，萌發(fā)的腋芽也逐漸黃化死亡，9個(gè)月后全部死亡，而處理9，10試管苗保存9個(gè)月后分別保持了66.7%和83.3%的存活率。試驗(yàn)結(jié)果表明，較低濃度的甘露醇（10 g/L和20 g/L）結(jié)合中高濃度的蔗糖有利于試管苗的保存，以20 g/L甘露醇+80 g/L蔗糖處理保存效果明顯。

處理5，6，9，10間試管苗株高差異顯著，其中處理5，6的試管苗顯著高于處理9，10的，說明蔗糖和甘露醇綜合濃度較高，即滲透壓較高時(shí)，馬鈴薯試管苗株高相對(duì)較低。高濃度蔗糖可誘導(dǎo)試管苗結(jié)薯，試管薯在保存3個(gè)月后形成，處理9，10的平均結(jié)薯數(shù)顯著高于處理5，6，達(dá)到1個(gè)/株左右，在保存后期植株死亡后，試管薯轉(zhuǎn)接至快繁培養(yǎng)基上可形成正常植株繼續(xù)生長。

圖5 不同配比蔗糖和甘露醇對(duì)馬鈴薯試管苗存活率的影響

圖6 不同配比蔗糖和甘露醇對(duì)馬鈴薯試管苗株高和結(jié)薯數(shù)的影響

3 小結(jié)與討論

通過提高培養(yǎng)基的滲透壓可延緩植物生長。常用滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)有甘露醇、蔗糖等[6～8]。相對(duì)于蔗糖，甘露醇不易被植物吸收，在種質(zhì)保存應(yīng)用中，甘露醇的作用是提高培養(yǎng)基滲透壓，從而抑制保存材料的生長。甘露醇對(duì)外植體生長的抑制作用持久，其作用機(jī)理是消除了細(xì)胞擴(kuò)大生長所必需的膨壓，同時(shí)細(xì)胞壁酶活性也受到抑制，使細(xì)胞生長受阻，減少了養(yǎng)分消耗[9]。Withers等[10]和Ng等[11]使用濃度為4%甘露醇來保存種質(zhì)，在8℃培養(yǎng)溫度下，可使繼代周期超過1 a。甘露醇雖然能夠延緩試管苗的生長，但是，濃度高于5%時(shí)，會(huì)造成植物生活力下降[12，13]。本試驗(yàn)中，試管苗在無甘露醇的培養(yǎng)基中保存6個(gè)月時(shí)全部死亡，添加10～30 g/L的甘露醇后，存活率大大提高，均達(dá)到70%以上，能保存到9個(gè)月以上。

離體培養(yǎng)條件下,糖類物質(zhì)是試管苗生存和生長的主要碳源，同時(shí)可維持培養(yǎng)基的滲透壓。本試驗(yàn)的結(jié)果也充分證明了這一點(diǎn)，不加蔗糖的處理，因碳源不足試管苗生長緩慢，生長勢(shì)弱。若植株靠自身微弱的光合作用合成少量的碳水化合物來維持其生長發(fā)育，一般保存時(shí)間不超過3個(gè)月。隨著附加蔗糖濃度由30 g/L增加到80 g/L，蔗糖表現(xiàn)出明顯的由作為碳源向作為滲透物質(zhì)的過渡。當(dāng)蔗糖濃度為30 g/L時(shí)，碳源充足，植株長勢(shì)良好，即使附加10～30 g/L的甘露醇也不能有效地減緩其生長速度，保存到6個(gè)月時(shí)試管苗已嚴(yán)重衰老，死亡嚴(yán)重，9個(gè)月后全部枯死；而當(dāng)蔗糖濃度增加到80 g/L，并配合20 g/L甘露醇時(shí)，試管苗生長極其緩慢，保存9個(gè)月后仍有83.3%的存活率。

本研究結(jié)果表明，馬鈴薯試管苗的離體保存完全可以達(dá)到短期保存的目的。在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的蔗糖和甘露醇，利用蔗糖在培養(yǎng)基中的雙重作用及甘露醇的滲透調(diào)節(jié)作用，在添加80 g/L蔗糖和20 g/L甘露醇的培養(yǎng)基中取得了良好的保存效果，能最大程度地延緩馬鈴薯試管苗的生長，繼代周期在9個(gè)月以上。但為了種質(zhì)安全，保存材料應(yīng)適當(dāng)增加備份，每2～3個(gè)月檢查1次，當(dāng)存活苗顯著減少時(shí)，應(yīng)及時(shí)恢復(fù)培養(yǎng)，使試管苗恢復(fù)生長活力，然后再進(jìn)行下一周期的保存。另外種質(zhì)離體保存除利用調(diào)節(jié)蔗糖濃度與添加甘露醇等措施外，還常與低溫處理等結(jié)合，因此，應(yīng)深入開展將低溫處理、調(diào)節(jié)蔗糖濃度及添加甘露醇等結(jié)合對(duì)馬鈴薯離體保存影響的研究，以期進(jìn)一步延長保存的時(shí)間、提高成活率。

[1]陳輝，陳曉玲，陳龍清，等.百合種質(zhì)資源限制生長法保存研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33（4）：789-793.

[2]牛愛國，張開春，張曉明，等.櫻桃種質(zhì)資源試管苗保存方法[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32（2）：298-300.

[3]艾鵬飛，羅正榮.柿和君遷子試管苗緩慢生長法保存及其遺傳穩(wěn)定性研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31（4）：441-446.

[4]權(quán)銀，陳竹生，郭天池，等.柑橘種質(zhì)的離體保存[J].中國南方果樹，1996，25（4）：3-5.

[5]Hao Y J,Deng X X.Cytological and molecular evaluation of strawberry plants recovered from in vitro conservation by slow-growth [J].Journal of Horticultural Science and Biotechnology,2005,80(5):588-592.

[6]Westcott R J.Tissue culture storage of potato germplasm.2.Use of growth retardants[J].Potato Res,1981,24:343-352.

[7]張進(jìn)仁，陳善春.柑桔種質(zhì)離體保存研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1997，22（4）：373-378.

[8]權(quán)銀.柑桔種質(zhì)離體保存研究進(jìn)展（綜述）[J].亞熱帶植物通訊，1996，25（2）：47-51.

[9]董龍英，顏季瓊.6-BA，甘露醇對(duì)黃瓜子葉細(xì)胞擴(kuò)大生長和細(xì)胞壁酶活性的影響[J].植物生理學(xué)通訊，1992，28（1）：47-50.

[10]Withers L A,Wheelans S K,Williams J T.In vitro conservation of crop germplasm and the IBPGR databases[J].Euphytica,1990,45:9-22.

[11]Ng S Y C,Ng N Q.Reduced-growth storage of germplasm.In:Doddsed J H,In vitro methods for conservation of plant genetic resources[M].London:Chapman and Hall,1991:93-109.

[12]辛淑英，謝欣.甘露醇濃度對(duì)百合種質(zhì)離體保存的影響[J].作物品種資源，1995（3）：50-52.

[13]史永忠，鄧秀新.柑橘種間體細(xì)胞雜種植株遺傳變異研究[J].園藝學(xué)報(bào)，1999，26（1）：19-22.