丁忠陽(yáng)

(無(wú)錫市人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214023)

腦水腫是由于各種致病因素導(dǎo)致的過(guò)多水分積聚在腦細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外間隙，引起腦容積增大。創(chuàng)傷性腦損傷是造成腦水腫最常見(jiàn)原因，可進(jìn)一步引起顱內(nèi)壓升高，危及患者生命，是神經(jīng)外科需要解決的一大難題［1，2］。近年研究表明，腦組織中水通道蛋白4(AQP4)參與了神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的腦水腫形成，而且在病理過(guò)程中產(chǎn)生的大量氧自由基對(duì)腦水腫形成也起至關(guān)重要作用［3］。依達(dá)拉奉作為抗氧自由基類(lèi)藥物是治療腦水腫的常用藥物。2010年1～6月，本研究通過(guò)觀察創(chuàng)傷性腦水腫大鼠不同時(shí)間腦組織AQP4的水平，探討依達(dá)拉奉對(duì)腦水腫大鼠AQP4表達(dá)是否具有調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠75只(雄性，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;依達(dá)拉奉注射液購(gòu)自南京先聲東元制藥。

1.2 模型建立及分組 75只大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和治療組，每組25只。每組分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只。模型組及治療組均根據(jù)Feeney等方法，首先使用水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠并預(yù)留心導(dǎo)管。然后將大鼠固定在立體定位架上，將頭部去毛暴露出頭皮，常規(guī)局部消毒后，無(wú)菌條件下切開(kāi)頭皮，暴露左頂骨。用牙鉆于矢狀縫左旁開(kāi)2 mm、冠狀縫后1 mm處鉆一直徑約為2 mm孔，逐步擴(kuò)大形成直徑約6 mm的骨窗，暴露硬腦膜。爾后，將撞擊裝置的撞桿頭端置于骨窗處，將撞擊錘從30 cm高度自由落下，撞擊撞桿，建立重度顱腦損傷模型，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮［4］。對(duì)造模大鼠進(jìn)行觀察，確定造模成功后，治療組大鼠腹腔注射3 mg/kg依達(dá)拉奉溶液，每12 h注射一次，連續(xù)治療5 d;模型組大鼠僅給予等量生理鹽水。對(duì)照組大鼠給予假手術(shù)處理:如上述操作對(duì)顱骨開(kāi)窗，暴露硬腦膜，但不進(jìn)行撞擊，然后骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，僅給予等量的生理鹽水。分別于給藥治療后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d 處死各組大鼠，開(kāi)顱取出腦組織。以損傷部位為中心，將腦組織平均分成兩份，稱(chēng)質(zhì)量后置于液氮中備用。

1.3 腦含水量測(cè)定 取各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織一份，于100℃恒溫箱中干燥至恒重后，計(jì)算腦組織中的含水量，比較各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦含水量的變化。

1.4 腦組織AQP4 mRNA的測(cè)定 取各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織一份，在無(wú)菌條件下按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)中方法提取腦組織總RNA，測(cè)定RNA含量;然后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)方法設(shè)計(jì)引物［5］:上游序列5'-TTGGACCATCATAGGCGC-3'，下 游 序 列 5'-GCATGTTGATCGACATTGACC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng) 214 bp。PCR擴(kuò)增程序:92℃變性2 min，56℃退火40 s，72℃延伸2 min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)定目的基因和內(nèi)參GAPDH條帶的光密度值，計(jì)算AQP4 mRNA表達(dá)的水平，比較各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織AQP4 mRNA水平的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果用表示，比較采用q檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型大鼠觀察 造模成功后，模型組挫裂傷灶處、蛛網(wǎng)膜下腔、皮質(zhì)表面出現(xiàn)不同程度出血，隨著時(shí)間延長(zhǎng)出血癥狀持續(xù)加重，腫脹明顯。3 d后，出血開(kāi)始緩慢吸收，腫脹逐步減輕。治療組出血及腫脹改善情況優(yōu)于模型組，出血量較少，腫脹程度較輕，1 d后出血開(kāi)始被吸收，腫脹減輕，3 d后充血水腫得到明顯改善。

2.2 三組不同時(shí)間腦組織含水量變化 見(jiàn)表1。

2.3 三組不同時(shí)間腦組織AQP4 mRNA水平變化見(jiàn)表2。

3 討論

表1 三組不同時(shí)間腦組織含水量變化(%，)

表1 三組不同時(shí)間腦組織含水量變化(%，)

注:與對(duì)照組同時(shí)間相比，*P＜0.05;與模型組同時(shí)間相比，△P＜0.05

組別 n 6 h 12 h 1 d 3 d 5 d對(duì)照組 5 63.28 ±1.43 64.82 ±1.21 63.87 ±1.09 65.79 ±0.98 64.77 ±1.56模型組 5 70.43 ±1.87* 74.61 ±1.45* 77.86 ±1.85* 80.95 ±2.75* 79.49 ±2.90*治療組 5 68.49 ±1.44* 69.55±2.01＊△ 69.21 ±2.68＊△ 66.31±2.34△ 64.38 ±2.69△

表2 三組不同時(shí)間腦組織AQP4 mRNA表達(dá)(光密度比值，)

表2 三組不同時(shí)間腦組織AQP4 mRNA表達(dá)(光密度比值，)

注:與對(duì)照組同時(shí)間相比，*P＜0.05;與模型組同時(shí)間相比，△P＜0.05

組別 n 6 h 12 h 1 d 3 d 5 d對(duì)照組 5 0.783 ±0.067 0.769 ±0.081 0.772 ±0.063 0.786±0.081 0.794 ±0.093模型組 5 1.452 ±0.123* 1.573 ±0.141* 1.891 ±0.088* 1.804 ±0.213* 1.785 ±0.154*治療組 5 1.265±0.154＊△ 1.195±0.162＊△ 1.107±0.153＊△ 0.856±0.095＊△ 0.815 ±0.099△

近年來(lái)，AQP4對(duì)腦水腫形成的影響一直是研究熱點(diǎn)。AQP4是一類(lèi)具有同源四聚體結(jié)構(gòu)組成的膜通道蛋白家族，主要分布于腦表面的軟腦膜、腦室系統(tǒng)的室管膜，特別是在與腦毛細(xì)血管緊密接觸的膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上高水平表達(dá)，為膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液和血管間水分的轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)構(gòu)建重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［1，5］。研究表明，腦組織中AQP4很可能是腦脊液重吸收以及腦水腫形成的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，而且腦出血后產(chǎn)生的大量氧自由基對(duì)腦水腫的形成也起著重要作用，這預(yù)示了AQP4膜蛋白與氧自由基之間可能存在某種聯(lián)系。

新型自由基清除劑——依達(dá)拉奉在體內(nèi)以陰離子形式存在，通過(guò)轉(zhuǎn)移電子給自由基而發(fā)揮清除自由基和打斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈的作用，可抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞以及腦神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)氧化。藥理研究已證實(shí)，依達(dá)拉奉能減輕各種模型動(dòng)物腦缺血引起的腦水腫及組織損傷，保護(hù)作用明顯［1］。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉可以明顯降低創(chuàng)傷性腦水腫大鼠腦組織含水量以及AQP4 mRNA表達(dá)水平;治療組大鼠各時(shí)間點(diǎn)水腫程度較模型組均有所降低，強(qiáng)度減弱;且連續(xù)給予依達(dá)拉奉治療5 d后，腦組織含水量降為正常水平，比模型組大鼠降低約15%;腦組織AQP4 mRNA表達(dá)也接近正常水平，此時(shí)模型組大鼠的腦組織AQP4 mRNA表達(dá)水平是治療組大鼠的一倍。其機(jī)制可能是依達(dá)拉奉有效阻斷腦組織中自由基反應(yīng)，減弱蛋白激酶C的磷酸化過(guò)程，抑制AQP4的表達(dá)上調(diào)，從而減輕腦水腫形成。

［1］湯崇輝，劉偉國(guó).水通道蛋白4與創(chuàng)傷性腦水腫研究進(jìn)展［J］.浙江創(chuàng)傷外科，2009，l4(1):84-86.

［2］陳壘，劉躍亭，段虎斌，等.小劑量多巴胺對(duì)大鼠顱腦創(chuàng)傷后水通道蛋白4表達(dá)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2009，7(11):1319-1321.

［3］孫彬，衣服新，張樹(shù)恒.依達(dá)拉奉對(duì)大鼠腦出血后水通道蛋白4及血腦屏障的影響［J］.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，28(6):35-38.

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