高金梅，張敬偉

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211)

2009年5～11月，我們對60例肥胖伴高脂血癥患者載脂蛋白E(ApoE)基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測，探討兩者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇肥胖伴高脂血癥患者60例(觀察組)，男38 例，女22 例;年齡(53.3 ±7.1)歲。均符合高脂血癥［空腹12 h血漿TG≥1.7 mmol/L和(或)TC≥5.7 mmol/L)及肥胖(超過標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量的20%)］診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選健康體檢者48例作為對照組，其中男29例，女19例;年齡(51.6±4.3)歲。兩組血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)各項指標(biāo)均在正常范圍，心電圖及腹部B超未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重疾病，一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2 ApoE基因多態(tài)性檢測

1.2.1 DNA提取(血液) 加入等體積的PBS磷酸鹽緩沖液，充分混勻后12000 r/min離心5 min，棄上清;加400 μl STE，10%SDS 40 μl，蛋白酶-K 10 μl(10 mg/ml);56℃水浴4 h;等體積飽和酚，倒轉(zhuǎn)搖勻。12000 r/min離心5 min，吸上層入另一1.5 ml離心管;上清液加等體積的氯仿，倒轉(zhuǎn)混勻。12000 r/min離心5 min，吸上層入另一1.5 ml離心管;上清液加等體積氯仿，倒轉(zhuǎn)混勻10 min，12000 r/min 5 min，取上清入另一管;加1 ml 70%乙醇洗滌，12000 r/min低溫(4℃)離心10 min，去上清，重復(fù)1次;自然干燥后，用pH 8.0 TE溶解，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 人基因組DNA消化 用75%乙醇將DNA洗滌兩次后于室溫倒置晾干至DNA沉淀變白，根據(jù)沉淀量加入合適體積去離子水(10～50 μl)于37℃水浴過夜消化DNA。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異擴(kuò)增 ApoE引物設(shè)計:5＇-AGAGAATTCGCCCCCGGCCTGGTACAC-3＇，5＇-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3＇，244 bp。PCR反應(yīng)體系為 50 μl，其中包括 DNA 10 μl，Premix Taq 25 μl，50 pmol/L，上游引物 1.0 μl，50 pmol/L，下游引物 1.0 μl，DMSO 5.0 μl，dd H2O 8.0 μl。PCR 循環(huán)條件:97℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃再延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.4 ApoE基因限制性酶切及銀染 取2 μl擴(kuò)增產(chǎn)物加入限制性內(nèi)切酶 HhaⅠ 0.8 μl(5 U/μl)、1 μl酶切緩沖液及6.2 μl去離子水混合后于37 ℃水浴過夜消化。8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠板固定于電泳裝置上，沖洗梳孔，于4℃冰箱中200 V下先預(yù)電泳30 min，上樣后繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)距離膠板下緣0.5 cm時停止電泳準(zhǔn)備進(jìn)行銀染。固定液:無水乙醇100 ml+5 ml冰乙酸+895 ml蒸餾水;染色液:0.2%AgNO31000 ml;顯色液:15 g NaOH+10 ml甲醛+990 ml蒸餾水。將凝膠放入預(yù)冷的固定液中固定15～20 min(避免晃動):蒸餾水沖洗干凈后置于預(yù)冷的染色液中，輕微搖晃15～20 min使凝膠均勻上色;再用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈后放入顯色液中，輕微搖晃使凝膠均勻染色，適時停影。根據(jù)泳帶位置判斷各樣品ApoE基因型，照相記錄結(jié)果或?qū)⒛z干燥后進(jìn)行保存。

1.3 血脂水平檢測 采用全自動生化分析儀檢測觀察組基因頻率較高的血脂水平(TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，組間均數(shù)比較采用t檢驗，計量資料以表示，基因頻率比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組ApoE基因型分布 觀察組E2/E2型1例(1.7%)、E2/E3型9 例(15.0%)、E2/E4 型 1 例(1.7%)、E3/E3型37例(61.6%)、E3/E4 型 10 例(16.6%)、E4/E4 型2 例(3.4%)，對照組分別為 1例(2.1%)、6 例(12.5%)、2 例(4.2%)、33 例(68.7%)、4 例(8.3%)、2 例(4.2%)，觀察組 E3/E3型基因頻率明顯高于對照組(P＜0.05);E2/E3型、E3/E3型、E3/E4型為觀察組基因頻率較高的基因型。

2.2 觀察組ApoE不同基因型血脂水平比較 見表1。

表1 觀察組E2/E3型、E3/E3型、E3/E4型血脂水平比較()

表1 觀察組E2/E3型、E3/E3型、E3/E4型血脂水平比較()

注:與 E2/E3型比較，*P ＜0.05;與E3/E3型比較，△P ＜0.05

觀察項目 E2/E3型 E3/E3型 E3/E4型TC(mmol/L) 6.20 ±0.46 6.26 ±0.75 6.73 ±0.37＊△TG(mmol/L) 2.35 ±1.61 2.50 ±0.97 2.89 ±0.81＊△HDL-C(mmol/L)1.35 ±0.30 1.17 ±0.10*1.20 ±0.10*LDL-C(mmol/L) 3.30 ±0.60 3.62 ±0.85*4.05 ±0.75＊△ApoA1(g/L) 1.45 ±0.42 1.42 ±0.17 1.49 ±0.24 ApoB(g/L)0.73 ±0.25 0.80 ±0.30 0.80 ±0.24

3 討論

在ApoE4/4表型中，第112位和158位均為精氨酸，其密碼子為 CGC，為 HhaⅠ酶切位點(GCGC)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HhaⅠ酶切后可產(chǎn)生72 bp、48 bp、35 bp和19 bp四個片段;ApoE2/2中，這兩個位置均為半胱氨酸，其密碼子為TGC，不構(gòu)成HhaⅠ酶切位點，酶切后只有91 bp和83 bp兩個條帶;ApoE3/3則在112位為半胱氨酸，158位為精氨酸，僅含有一個HhaⅠ酶切位點，酶切后產(chǎn)生91 bp、48 bp和35 bp;以此類推，其他三個雜合子ApoE2/3、ApoE2/4、ApoE3/4得到相應(yīng)的電泳條帶，因此ApoE的基因型可根據(jù)HhaⅠ酶切擴(kuò)增產(chǎn)物后的電泳圖譜進(jìn)行鑒定。ApoE是血漿脂蛋白的重要組成成分，研究表明，ApoE基因多態(tài)性影響個體的血脂水平［1，2］。在正常體重人群中，不同 ApoE 基因型TC、HDL-C水平無明顯差異，而超重或肥胖人群中，不同ApoE基因型TC、HDL-C水平明顯不同［3］。另有研究表明，ApoE基因型與冠狀動脈性心臟病和原發(fā)性高血壓的發(fā)病率有相關(guān)性［4～6］。ApoE基因多態(tài)性可能通過影響脂代謝進(jìn)而影響這些疾病的發(fā)生和預(yù)后。

本研究觀察組E3/E3型基因頻率高于對照組;觀察組E3/E3型及E3/E4型HDL-C水平明顯低于E2/E3型，LDL-C明顯高于E2/E3型;E3/E4型TC、TG、LDL-C水平明顯高于E3/E3型。提示，ApoE基因型中E3/E3型的肥胖者可能更易患高脂血癥。

總之，ApoE基因多態(tài)性與肥胖伴高脂血癥發(fā)病具有相關(guān)性，ApoE基因型中E3/E3型的肥胖者可能更易患高脂血癥。

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